【Invitrogen】提速:快速高效的转染级别高纯度质粒纯化[选购宝典]

【字体: 时间:2005年07月19日 来源:Invitrogen

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Invitrogen供稿

    PureLink™ HQ Mini质粒纯化试剂盒特别为从多种类型的细菌菌株中快速、高效地纯化可用于转染的高纯度质粒DNA而设计,每次纯化最高可得到60微克的高纯度质粒DNA!纯化的质粒质量高、产率稳定可靠、可重复性好,完全适用于各种下游操作,如:酶切、自动荧光测序、Gateway克隆、转化细菌――特别值得注意的是可用于转染哺乳动物细胞。

    传统的碱裂解法提取细菌质粒,首先用含有RNAse的溶液悬浮细胞;加入含有去垢剂的碱裂解液来裂解细菌,同时也使DNA变性;再加入用于中和的缓冲液(通常是醋酸钾缓冲液)使高分子的蛋白和基因组DNA沉淀下来;这样就可以通过离心或过滤的方法轻易地去除这些杂质;而环状的质粒DNA经过中和后复性,成为可溶状态而留在上清溶液中;最后往往借助异丙醇沉淀从溶液中分离出质粒DNA。现在,基于硅介质技术的纯化系统日渐流行,主要是因为这种技术就能得到质量和纯度足以满足大多数的分子生物学应用需要的质粒,而价格比起阴离子交换柱更加便宜,操作更加快速方便。在较高浓度的离液盐(chaotropic salts)环境下,溶解于溶液中的质粒DNA能结合于硅树脂上,然后可以用低盐缓冲液或水将质粒DNA洗脱下来。但是常规的这种快速纯化方法不适宜用于纯化大拷贝质粒,而且得到的质粒通常不宜用于转染。

    PureLink™ HQ Mini Plasmid DNA Purication Kit所采用的也是基于硅介质技术的离心纯化柱,而纯化得到的质粒DNA不单可以用于如酶切、PCR、测序、细菌转化等用途,更可以用于哺乳动物细胞的转染。而特别值得注意的是,这个试剂盒的操作方法非常简单――同样是基于碱/SDS裂解法,改良的玻璃微纤维柱专一结合质粒DNA,经过洗涤纯化柱去除基因组DNA或者RNA的污染,最后用低盐溶液洗脱。
 
高达60微克的大容量


    分别从1.5, 3, 6, 9x109个大肠杆菌细胞中提取质粒DNA(pcDNA3.1/CAT)。其中PureLink™ HQ Mini试剂盒纯化程序是分别裂解1.5x109的细菌,将离心得到的上清液合并上柱从而得到相应的细胞数。最后都是用100微升洗脱缓冲液一次洗脱。

    常规的”mini”质粒纯化试剂盒在开始的1.5x109 的细菌质粒纯化时表现与HQ相当,当增加细胞的量时,比如到9x109个大肠杆菌细胞时,常规的mini纯化柱很快的超 “负荷”到达纯化柱的载量极限,而采用PureLink™ HQ Mini试剂盒则可以得到超过60微克的质粒,产量比常规试剂盒平均提高35%。

纯化大型质粒

    常规的硅胶膜技术并不适宜提取较大的质粒,洗脱得率很低。采用PureLink™ HQ Mini试剂盒从1ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取40kb大小的p5L393质粒,也可以得到3-7ug/ml的产率,OD260/280比值在1.86±0.07左右。在标准条件下限制性内切酶可以完全酶切质粒并得到所需的条带,而且目测不到基因组DNA或者RNA的污染(<5%)。

 
质粒酶切电泳图
泳道1:p5L393/HindⅢ
泳道2:p5L393/AvaⅠ
泳道3:p1Kbplus/BamHⅠ
泳道4:1Kb Plus DNA ladder
泳道5:1 Kb DNA Extension Ladder

转染哺乳动物细胞
    转染,是在哺乳动物细胞中导入外源基因并进行表达和研究的重要手段。转染成功的关键要素之一在于质粒DNA的质量――超螺旋DNA的比率、RNA污染、内毒素等等。采用PureLink™ HQ Mini试剂盒纯化的质粒能够稳定高效地转染多种细胞株,见下图:

    特别值得一提的是,PureLink™ HQ Mini试剂盒纯化得到的质粒其内毒素含量明显低于已知文献中用硅胶填料纯化所得质粒的内毒素水平(Qiagen, Product Guide 2003, p. 119-120),实际上,PureLink™ HQ Mini试剂盒纯化得到的质粒其内毒素水平仅仅略高于用离子交换方法纯化的质粒样品,同样达到转染标准,但是操作就简单快速多了。根据文献(Fox et al., BioTechniques, 2000, 29: 610–619)所载,对于多数常用的细胞株来说,DNA中的内毒素水平超过2000 EU/µg时会显著抑制转染。
 
酵母质粒的纯化
    酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的常用工具。在筛选后的一个通用步骤是通过“再转化”来确证筛选得到的阳性克隆――就是从阳性克隆的酵母菌株中提取质粒DNA,转化大肠杆菌,找到带有“猎物”的质粒DNA,并分析其DNA序列。

    我们用PureLink™ HQ Mini试剂盒成功在酵母细胞中提取高质量的质粒DNA。只需要先用专门消化真菌细胞壁的zymolyase酶消化酵母细胞壁,再用PureLink™ HQ Mini试剂盒标准步骤就可以从酵母中提取高质量的质粒DNA。整个过程简单、迅速,可重复性高,并可以用于常规提取酵母低拷贝(ARS/CEN-based)和多拷贝(2u-based)的质粒,提取的质粒可以用于PCR和细菌转化等操作。

不惧低拷贝
  
 在土壤杆菌介导的植物转化中用到的载体通常都是低拷贝的。在转染植物之前,通常会用A. tumafaciens细胞来筛选质粒。对HQ kit进行一些改动(增大中和/结合缓冲液体系,加入35%盐酸胍,40%异丙醇,50μl连续洗两次)就可以快速、高效、可重复地提取这种低拷贝的质粒,比如:14kb大小的pBⅠ121质粒。提取的质粒可以用于酶切分析和大肠杆菌的转化。

     从上述介绍我们可以看出,PureLink™ HQ Mini试剂盒的优点在于
* 可以从多种细菌和酵母中快速、高效纯化各种高拷贝或者低拷贝的质粒,得到高质量的质粒DNA
* 超高柱载量可以让你一次收获更多的质粒
* 极低的基因组DNA和RNA污染保证高纯度质粒DNA
* 可以纯化高达40kb的大型质粒
* 纯化的质粒DNA可用于各种常规下游应用,如酶切、细菌转化、自动荧光测序、Gateway克隆、体外转录和体外翻译
* 纯化的质粒内毒素低,超螺旋比率高――可稳定高效转染多数常用的哺乳动物细胞株

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