RNAi实验不可忽视的方面[选购宝典]

【字体: 时间:2006年10月11日 来源:生物通

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  如果你正准备在你的研究中引入RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),首先你会考虑什么呢?技术路线?设计siRNA序列?还是预计实验结果?这些应该说都是不可或缺的注意焦点,但是有一个重要的方面或许你会忽略,那就是选择一套验证实验设计系统的对照组。

如果你正准备在你的研究中引入RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),首先你会考虑什么呢?技术路线?设计siRNA序列?还是预计实验结果?这些应该说都是不可或缺的注意焦点,但是有一个重要的方面或许你会忽略,那就是选择一套验证实验设计系统的对照组。

一个完整的siRNA实验应该有定性检测阳性对照和阴性对照,通过这些对照研究人员可以在一个新的细胞系中建立RNAi系统,确定siRNA介导的RNA干扰在其使用的细胞系中是否有效,并且一旦出现成功的RNAi,可以进一步优化实验。而且从对照中分析得到的数据对于严谨和有效的RNAi实验也是必不可少的。

其中作为阴性对照(nonsilencing siRNAs)的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱,当然同样要保证它和其它基因没有同源性;而作为阳性对照的siRNA则应该是那些已知具有高水平基因敲除的siRNA——这样能通过常规转染siRNA,确保实验条件没有出现问题,以及实验结果的可靠性,比如GAPDH siRNA 是最为常用的一种,也有使用其它一些看家基因的siRNA作为RNAi阳性对照来摸索转染条件。

许多家公司都有提供所谓的“starter”试剂盒(starter kits),这些试剂盒的好处其实就在于省事省心,对于标准化实验来说,像是Western Blot,实时定量PCR反应,免疫荧光检测,以及酶学分析这些检验性实验对照当然是不可或缺的,有时要准备却十分的麻烦,因此有统一的对照节约时间和精力。另外就是有一些试剂盒包含了转染试剂和鉴定细胞增殖能力的试剂等,可以把开始着手进行RNAi实验所需要的东西都包含在内,对于一些新进接触这一领域实验的来说十分的方便。

BLOCK-iT™ RNAi Basic Control Kit

这个试剂盒系出名门:出自Invitrogen公司的BLOCK-iT™ RNAi技术系列产品。BLOCK-iT™ RNAi技术是利用体外转录和切割(Dicing)形成d-siRNA 双链体的复合池,继而经过转染进入细胞的过程(具体见下)。


(来自http://www.invitrogen.com.cn/newproducts/main/BLOCK-iT_RNAi_kit.htm)

这个过程可以很快产生结果(构建d-siRNA池),无需再花费时间设计和检测多个序列,确定哪一个将会导致显著的基因表达阻断。

BLOCK-iT™RNAi Basic Control试剂盒则是隶属于这个系列产品中的一个“先锋”产品,这个试剂盒包含了确保有效RNAi实验最佳条件的所有试剂:BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo帮助研究人员获得RNAi转染有效性可视检测;阳性和阴性RNAi对照则是通过提供能敲除实验细胞系中一个基因(p53)的 LUX™引物进行的qRT-PCR,同时试剂盒也包括了在RNAi实验室过程中评估细胞活力的Nuclei Stain和Dead Cell试剂。总之这一“全能性”的试剂盒实现的就是对照的高标准:有效对照、可重复性、便于优化实验条件。

 

RNAi Human/Mouse Starter Kit

Qiagen的这一款RNAi Starter试剂盒有人类和小鼠两个系统,主要包含的试剂就是阴性和阳性对照,其特点如下:

  • 建立和优化RNAi系统的完整对照系
  • 高转染率,高灵敏度(HiPerFect试剂)
  • Alexa Fluor 488标记的阴性对照提供了方便的转染率监控
  • 灵活的敲除确认(利用其它Qiagen的western blot或者qRT-PCR工具)

Qiagen的RNAi Starter试剂盒优点就在于,配合Qiagen的其它产品,确实获得的对照效果很不错:

阴性对照是Alexa Fluor 488标记的nonsilencing siRNA,与哺乳动物基因没有已知的同源性,作为阴性对照,这种siRNA可以通过荧光显微镜很方便的监测到,并且由于Alexa Fluor 488荧光分子比其它荧光标记更亮更耐光(photostable),对pH值的耐受性范围也较大,因此在活细胞中更稳定。


(5 nM的Alexa Fluor 488标记的nonsilencing siRNA转染(HiPerFect)HeLa24小时后荧光显微照片,其中绿色荧光为对照siRNA,蓝色为活细胞染料Hoechst 33342染色的细胞核)

阳性对照是MAPK1 siRNA(人类和小鼠),这种蛋白激酶(也称为Erk2和MAPK2)在人类和小鼠细胞系中有广泛表达——Western blot的分析结果表明MAPK1是普遍表达的。这种阳性对照是通过Qiagen特有的 HiPerformance siRNA Design Algorithm设计得到的靶向MAPK1的高纯度siRNA,在人类和小鼠基因序列里有100%的同源性。另外,阳性对照当然要看的就是敲除效果。MAPK1阳性对照siRNA可以有效的去除人类和小鼠细胞系中的MAPK1表达,见下,同时这一试剂转染方便,确保实验结果一致。


(WB检测结果:用靶定一人类和小鼠MAPK1 mRNA常见序列的阳性对照siRNA和阴性siRNA对照转染MCF-7细胞,在转染和温育之后,通过MAPK1-specific Tag·100抗体和anti-tubulin一抗进行WB检测)]

 

 Silencer® siRNA Starter Kit

说到RNA技术,当然不能少了Ambion公司,Ambion的这一款Silencer siRNA Starter试剂盒是一对于新接触RNAi实验的研究人员十分适合的指导性试剂盒。这一试剂盒包含了利用RNAi技术沉默基因的试剂和指南,而且也可以用于siRNA传递实验条件的优化——其中包括:对照siRNAs,siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent转染试剂,以及三种不同的检测GAPDH((glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)基因沉默的试剂。

其中阳性对照是GAPDH siRNA,这种看家基因siRNA是常见的阳性对照,可以有效的引导人类,小鼠和大鼠细胞系中GAPDH基因的沉默。阴性对照即为与人类,小鼠和大鼠序列没有同源的nontargeting序列,而且阴性对照siRNA对mRNA和GAPDH siRNA的蛋白水平没有影响,并且可以作为检测GAPDH siRNA有效性的基线。除此之外,通过阴性对照可以识别非特异性siRNA,比如非序列特异性siRNA,以及转染试剂毒性或非优化条件造成的沉默。
(生物通:张迪)

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