[新品推荐]HaloTag技术=蛋白标记示踪+融合表达+蛋白分离

    随着基因组研究纵深与横向的不断发展，生命科学即将步入“后基因组时代”，研究重点的由单分子研究迅速移位至整体研究，而首先有待研究的“整体”，就是进行各种生命必不可少的生理活动的场所——细胞，而细胞研究的最终目标就是明确细胞内的各种事件是如何发生的，明了细胞内复杂的动态变化的生化机制。由于蛋白质是细胞内一切生命活动所必需的功能载体，如果能够通过标记蛋白质，让研究人员“看”到蛋白质在细胞内的分布和活动情况，无疑对阐明细胞内在机制是很有帮助的。因此细胞标记示踪技术也就成为了揭示活细胞动力学和蛋白质功能的一种重要手段。

    从免疫组化到原位杂交，研究人员一直在想方设法研究生物大分子——特别是各种蛋白质在细胞内的定位。随着荧光标记技术和显微成像技术的发展，使得在活细胞内追踪蛋白成为可能——但是用传统的荧光示踪方法来跟踪蛋白质在细胞内的活动，要求研究者精于蛋白质化学，能成功地将标记蛋白注射于细胞内，这需要高度的专业技术和设备支持；另一方面，通过克隆转染在细胞内合成蛋白，显然更适合用于研究蛋白定位的真相，因此，在一直在不断寻找更好的蛋白质示踪技术的过程中，HaloTag技术就这样应运而生。

    一项新技术经常会激发科学家的创造力，HaloTag可互换标记技术，正是这样一种集蛋白的位点特异性标记、活细胞蛋白荧光标记示踪，亲和处理及固相吸附于一身的创新技术。简而言之，HaloTag其实是一种分子量为33KD的蛋白Tag，可以高特异性和高亲和力地与几种不同颜色的HaloTag荧光配基或者生物素快速形成稳定的共价结合。当利用基因融合技术将目标蛋白和HaloTag融合表达后，在生理条件下就可以将HaloTag荧光配基或者生物素直接定点标记在融合蛋白的HaloTag上，这种共价结合特异性高，不可逆，形成快速，生成的复合物稳定性强，甚至在变性条件下也能如此，因此可以利用这个特性进行PAGE电泳胶显色，以及亲和纯化等目的。而当融合表达载体转染到活细胞中表达融合蛋白，就可以进行活细胞中的蛋白荧光示踪——追踪某个蛋白质的产生、分布定位、甚至蛋白质的迁移等情况。HaloTag配基的多样性使得HaloTag融合蛋白具有多种功能和较宽的光学检测范围——无需改变基本的遗传结构就可在不同的波长下进行细胞成像或结合新的功能团。

 

基本技术原理

原理其实很简单： 1.构建带有HaloTag和目标蛋白的融合表达载体 2.转染目标细胞，可按需要选择瞬时转染或稳定转染 3.培养细胞至表达产物 4.选择合适的荧光配基或生物素与细胞共同孵育5—60分钟，配基穿越细胞膜和HaloTag形成共价结合，然后洗掉未结合的配基 5.分析研究：比如活细胞荧光成像；或者固定细胞成像；细胞裂解以及蛋白亲和纯化/捕获，或凝胶分析。

技术解密

    HaloTag蛋白是一种分子量为33KD的单体蛋白，本身并不具有催化能力，而是蛋白水解酶的遗传修饰衍生物，可与多种HaloTag 配基形成有效的共价结合，包括红色荧光的TMR，绿色荧光的diAcFAM，蓝色荧光的Coumarin，以及生物素等。以HaloTag蛋白与TMR（一种荧光物质）配基共价结合的分子模式为例（见下）说明下蛋白—配基结合原理，HaloTag TMR配基（下图放大部分红色区域为功能区，桔色的为反应连接部位），配基上的苯丙氨酸残基（蓝色）替代了HaloTag蛋白的催化部位（组氨酸），使得之失活，这样破坏了其水解酯类中间体最终形成稳定的共价键。

    HaloTag配基通常是一些可穿越细胞膜的小分子化合物，主要包含两种关键成分：一个通用的HaloTag蛋白反应连接部位——其作用是启动与HaloTag蛋白的共价键的形成，和一个功能报告基团，如荧光染料TMR和diAcFAM，或亲和反应基团如生物素。在一般生理状态下，这种共价键结合是不可逆的，具有高度专一性，结合速度极快。由于HaloTag技术不需要将配基注入到细胞中，减少了对细胞的毒性，而且到目前为止通过对TMR，diAcFAM 和生物素等配基的细胞毒性检测也没有发现阳性反应，对细胞形态也无不良影响。HaloTag配基的多样性为研究人员提供多样的选择，满足不同的研究需要，因而拓展了HaloTag的应用。

应用的技术创新点

其实从上面的技术要点已经体现了许多HaloTag的技术优势，具体体现在应用方面主要有：

应用方面	技术优势
活细胞（固定细胞）成像	① 配基通过细胞膜与HaloTag形成稳定共价键，这种荧光信号对细胞固定剂的耐受使得对固定细胞的成像变得很容易，从而与免疫细胞化学技术和免疫组织化学技术共用成为可能                       ② 荧光强度高 ③ 优异的荧光信号的信噪比，使得可以在相对较低的表达水平下，检测出所表达的蛋白。 ④ 特异性强，HaloTag来源于原核细胞，哺乳动物无内源性HaloTag，因此配基和蛋白的集合是高特异性和高亲和性的 ⑤ 实现“脉冲-追踪”样标记
蛋白分析	① 蛋白—配基相互作用稳定，即使与SDS样品缓冲液一起煮沸，并且经SDS－PAGE 凝胶电泳分离后，也没有可测定的荧光信号损失。 ② 可以结合其它蛋白分析方法，例如Western Blot ③ 可使用多种荧光标记，实时监测蛋白表达
蛋白捕获（亲和标签）	① 通过配基的亲和臂，HaloTag技术可以用来捕获哺乳动物细胞中表达的 HaloTag融合蛋白 ② 获得的融合蛋白仍保留蛋白活性（具体见说明书）

    通过这三个方面，研究人员利用HaloTag技术可以成像活的或固定哺乳动物细胞，监测 HaloTag 融合蛋白在细胞内部的迁移，观察亚细胞结构或蛋白更新周期。并且也实现了细胞到凝胶的分析，可以从活细胞，或体外转录/翻译反应中，通过固相载体获得HaloTag融合蛋白或者蛋白复合物。

与其它相关技术比较：

• GFP技术

    荧光标记使用的较多的有GFP（green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）。GFP最大的优点是GFP受激发后可自发荧光而不需要其他荧光底物或者染料染色，因而很快成为非常出色的荧光报告标签，在探索生命现象过程中得到了非常广泛的应用——比如我们非常熟悉的各种GFP表达载体，也是做细胞内蛋白荧光定位的好方法。总的来说，HaloTag的优点是稳定性极高，荧光强度更高，有多种配基可选择，也可用于蛋白亲和纯化；而GFP系列的最大优点则是不需要底物或者染料。GFP系列并非仅有绿色——以前Clontech曾经推出过红色、黄色、远红外和蓝色荧光蛋白标记载体，不过每种颜色对应不同基因，无法象HaloTag实现一次构建对应多种不同的颜色选择；此外，GFP系列荧光也不够稳定，融合表达产物不能在PAGE变性凝胶中直接发光检测，还不能用于蛋白俘获或者是亲和纯化，也难以和免疫组化技术共用。还有人认为GFP的发光结构使得融合的目标蛋白容易发生构象改变。

	HaloTag	GFPs
Live Cell Imaging	Yes	Yes
Direct Protein Capture	Yes	NO
Stable to Fixation	Yes	Yes/No(红色荧光蛋白不稳定)
SDS-Page	Yes	NO
Endogenous Protein	NO	NO
Licensing Fees ( for profit)	None	Yes
pH Sensitivity	None	Yes

• 生物荧光

    生物荧光技术是近年来倍受瞩目的一种新型荧光技术，主要是通过萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)催化荧光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在荧光素氧化的过程中，发出生物荧光(bioluminescence)，然后通过荧光测定仪(luminometer)或液闪测定仪就可以测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。这种技术通过测定荧光素酶活性的高低来就可以判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。由于生物荧光不需要激发光就可以将化学光转换为生物光，因此没有本底影响，相关线性程度高，所以特别适合于药物筛选。

    但是生物荧光技术发光强度小，不适合用于活细胞和固定细胞成像，或者追踪整个细胞蛋白表达，因此在这方面还是需要化学荧光来实现实时监测蛋白表达。而这一方面正是HaloTag技术的优势，HaloTag蛋白和与其配基之间共价结合的稳定性，使得对固定细胞的成像变得很容易。也同样是由于这种稳定性，在转染之后仍然保持着明亮的荧光，因此可以用于免疫细胞化学技术和免疫组织化学技术，而且由于固定细胞成像稳定，也就可以用来通过自动扫描技术进行大量高通量细胞分析。

• 其它技术

    Invitrogen的Lumio技术和HaloTag有点相似，是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术，通过在目的蛋白中融合“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys”（4xCys + 2 除Cys外的任意氨基酸）片段，与一种联胂类荧光素衍生物耦合，使后者发荧光，从而实现蛋白的实时观测分析，并且可以通过电泳直接分析蛋白。与之相比，HaloTag的优势在于配基选择多（3种荧光+生物素），共价结合稳定使得发光性能稳定，灵敏度高，从而实现荧光标记、亲和纯化分离等多种功能，更为灵活。而Lumio的优势在于6个氨基酸的小Tag（大约0.5KD）对目标蛋白影响较小（不过由于太小，因而融合蛋白结合荧光底物的发光能力也就因目标蛋白而异）；另外还有个优点是底物不发光，结合Tag后才发光，所以本底很低，不需要洗去未结合底物。Lumio的底物目前只有红色和绿色荧光2种，前者对细胞形态有影响，发光稳定性差，多推荐用绿色。底物和Tag之间的结合发光是可逆的，因而不适宜表达量很低的情况，此外细胞染色后如果要做电泳需要另外处理（PAGE电泳显色和细胞染色操作上分属不同的试剂盒，使用成本高，操作也麻烦一些）；暂时都还不能用于蛋白质亲和纯化分离；价格上说，Promega的产品要实惠多了。

小结

    总的说起来，HaloTag技术是一个观察活细胞或固定(哺乳动物)细胞的全新的技术，目前这一系列的产品有在哺乳动物细胞内表达的HaloTag融合蛋白的pHT2 Vector，pFC8A CMB Flexie Vectors ，以及各种多功能的HaloTag配基，包括荧光标记、或是亲和性操作和连结至固态表面的应用。如果对这个新技术动心但又不放心的话，现在HaloTag有免费的载体试用，机会难得，大家一定要试试，链接http://www.promega.com.cn/cx/halotag/index.htm。（生物通：张迪 薇安）