如何进行蛋白设计？[心得点评]

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我们可以通过在蛋白模型和结构预测中的技术进步来构建具有新型功能的蛋白。

                                    ——HHMI，David Baker

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（Reprogrammed：这是通过计算机重新设计的endonuclease I-MsoI的结构，目的是使其靶向新的DNA位点。这种重新设计的酶与野生型相比，具有靶标识别水平上的位点改变特异性。这种方法目前已经应用于更多的靶标中去，例如基因疾病热点（hot spots）。

Imagine能根据需要来构建一种全新的蛋白——任何小分子的生物传感器，或者一种新型的酶。这不纯粹是幻想，计算结构生物学（Computational structural biology）能帮助我们实现这一想法。

世界上的许多研究团队一样，来华盛顿大学的HHMI研究员David Baker教授也已经开始初步设计新蛋白和蛋白的折叠，计算能折叠形成具有自然界中未被发现的酶活性的氨基酸序列。这种可行性仅仅受我们想象力的限制：绘制设计一种核酸内切酶来防止疟疾，检测生物恐怖试剂的分子传感器，或者一种阻止HIV进化的疫苗。

科学家们已经多年尝试开发一种能根据氨基酸序列来简易地预测蛋白结构的方法。想象只要具备一种生物的基因组的序列，科学家们就能够刻画出这种生物的每一种蛋白的结构，这将使得单从基因序列无法发现的蛋白的生物分子相互作用、结构同源性、功能作用和潜在的药物靶标得到揭示 。

虽然还存在漫长的路要走，但是在算法的改善和计算能力的增强的情况下，在蛋白结构预测和设计方面的令人兴奋进展一定到来。

Structure Prediction

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二十世纪七十年代利用RNAase进行的经典的实验证明了蛋白折叠所需的信息全部存在于自身的氨基酸序列中。这表明蛋白结构预测能直接进行。但是从序列到结构的预测就像是生物学中的“天气预报”，存在着困难。因为尽管一种相对小的蛋白也会存在着多种可能的构像。根据Levinthal's Paradox，假设每种氨基酸具有自由的三种轴对称转动度，含100个氨基酸残基的序列具有3100的可能构型。

为了攻克这个问题，David Baker等人已经开发了一种叫做ROSETTA的计算机程序，它的核心部分是一种计算给定蛋白构象的能量的方法。消除不可能的蛋白结构，例如暴露于溶剂中的疏水结构，该程序对所有的蛋白折叠的画面进行取样，检测大约一百万种具有最低能量结构的可能构象。

为了检验这一研究，自从1998年开始，David Baker和他的同事参加了一个叫做CASP (Critical Assessment of techniques for protein Structure Prediction; http://www.predictioncenter.org/)的世界性的结构预测实验，进入了ROSETTA预测程序的利用阶段。CASP于十多年前创立，是一种结构生物学证明平台，是一种要求参与者在蛋白结构被阐明担未公开的情况下预测蛋白的形状的团体性实验和竞争。然后这些预测与正确的结构相比较，举行会议讨论得到的结果，确定最具前景的预测方法和剩下仍未解决的最重大问题。虽然目前还没有一种算法能得到完全正确的结构，但是ROSETTA在这些测试中表现良好，并且每年我们的预测与其他小组的预测更加接近。

DE NOVO Desige

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蛋白设计是蛋白结构预测的相对面，蛋白设计中，我们寻找能按照一种方式折叠成具有执行预期功能的蛋白结构的序列。该领域已经在设计具有新功能和结构的蛋白方面取得了进展。1998年，加州理工大学的Stephen Mayo和合作者计算了一种折叠成自然发生的锌指结构的序列。2003年，北加州大学教授Brian Kuhlman，利用ROSETTA来设计一种十分稳定蛋白Top7，这种蛋白的序列和结构与所有的已知蛋白不相关。这种93种氨基酸的蛋白被证明是单体并且是折叠的，x光结构分析表明与预测非常吻合，证明该现代蛋白设计方法可以在原子水平上准确设计一种崭新的蛋白。

构建一种全新的蛋白结构传出令人兴奋的消息的同时，科学家们也正致力于在蛋白化学中另外的地方寻找已有的蛋白功能蛋白设计领域。例如Mayo, along with 和Bolon利用一种无催化活性的大肠杆菌蛋白-硫氧环蛋白作为一种新型的能催化组氨酸介导的乙酸对硝基苯酯水解的酶的骨架。宾西法尼亚大学的Bill DeGrado的研究小组在四螺旋组蛋白中创建了一种金属酶位点。与此同时杜克大学医学中心的Homme Hellinga和他的同事利用一种大肠杆菌周质空间结合蛋白朝家族的成员作为涉及TNT、葡萄糖 与其他分子的生物传感器的骨架。

令人瞩目的是，Hellinga和他的合作者成功的联合了他们新工程构建的生物传感器和细胞信号通路，培育了一种能在暴露于TNT时变成蓝色；这项工作为地雷的探测带来新方法。更近一段时间以来，Hellinga小组成功的将一种无催化活性的核糖结合蛋白转换成一种异常活跃的丙糖磷酸盐异构酶反应中的催化剂。下一步工作是创造不是由天然发生蛋白来催化化学反应的酶。这项工作是十分重要的，并且是一个艰难的挑战。

Interaction Disign

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除了催化剂的de novo设计法，更新的尝试是重新工程设计大分子之间相互作用的界面，或者在蛋白之间，或者在一种蛋白和核酸之间，这是一个十分重要的目标。大分子相互作用在细胞中起到十分关键的调节和功能作用。重新设计大分子的相互作用可以引导新药物、研究工具盒诊断方法的开发。

在David Baker研究小组中，Lukasz Joachimiak，其中一个学生，与现任加州大学教授Tanja Kortemme利用一种测试床（test bed）来检查colicin E7（一种非特异的DNAase）和它的抑制剂免疫蛋白Im7之间的相互作用。他们首次证实只要接触该复合体中的任一伴侣就会导致复合体不稳定。并且之后证实了可以通过一种成员的补偿效应来修复它们的相互作用。在这种方法中，他们开发了一种新的组成伴侣之间具有subnanomolar亲和力，但不能语同类的野生型伴侣相互作用的蛋白质—蛋白质对。
我们同样也进行设计一新的蛋白质—DNA之间相互作用的工作。例如，2002年，与华盛顿大学和西雅图的Fred Hutchinson癌症研究中心合作，通过融合来自两种独立的管家酶—I-DmoI 和I-CreI的区域，他们发现了一种新的核酸内切酶E-DreI。这种新型酶具有父本酶的DNA结合特异性。

最近，研究小组中的Jim Havranek扩展了ROSETTA设计方法来重新设计蛋白-DNA之间的相互作用的特异性。一个本科生Justin Ashworth计算设计了管家核酸内切酶I-MsoI切开一种新的DNA序列的界面。Justin的对这种重新设计的酶的实验描述表明该没能有效的切开新位点，但不是原始位点，并且高通量的结晶体结构分析证实设计的准确性。

同时研究小组现在也利用计算的设计方法试图建立一种有用的治疗用途的内切酶。设计而成的酶可以转入突变细胞或者生物体中，和一个突变基因的野生型拷贝一起驱动基因治疗。通过新型的酶来消除疾病基因之后，野生型序列可以推进DNA修复，因此修复了这种遗传缺陷。与世界范围的研究小组合作，我们试图设计一种新内切酶来失活疟原虫生存和传播所必需的蚊子基因。这种工程设计的酶可以在疟疾的消除计划中起到重要作用。

Other Applications

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除了以上提及的方面，其实蛋白设计方法在许多方面都具有不可预知的作用。比如许多重要的人类疾病，包括老年痴呆和帕金森综合症，都与蛋白的错误折叠形成淀粉纤维有关。UCLA 的David Eisenberg研究小组去年取得了弄清楚这种事件是怎样发生的重大突破，这是他们首次分析淀粉质形成多肽的高通量结构后发现的结果。ROSETTA中的设计方法被用于证实产生的淀粉结构的设计模型与序列一致。

蛋白设计同样具有商业性的应用。例如Xencor, 加州的一家蛋白设计公司，利用它的蛋白设计自动化技术开发了XPro-1595，一种肿瘤坏死因子α的负抑制剂，预期在2006年进入临床试验阶段。Sangamo Biosciences公司的研究者们最近宣布他们成功的利用一种新设计的锌指结构酶来修复基因。生物传感器，可以用于构建芯片，或者甚至调节移植的人工胰腺。

当创造全新的蛋白结构出现的情况下，当前蛋白设计领域的研究的目标是将别处发现的功能赋予现有蛋白的研究中
为了增强蛋白结构预测和设计相关联的庞大的构想和序列空间搜索，David Baker研究小组中的David Kim开发了一种分布式计算版本的ROSETTA，称作rosetta@home，可以用于集中世界上成千上万的电脑的计算能力。

最近一次统计，rosetta@home在全世界内具有67,000用户，可以产生组合的29负点运算的计算能力—足够其成为2005年11月公布的世界最顶尖的超级计算机排行榜的第八名。随之发生的网络计算能力在不断的增加速度，ROSETTA的结构预测方法可以进一步改善，同时也可以更快地检验新构想。 最近rosetta@home的用户正在检测预测CASP7结构的实验，将在8月4日结束。
CASP7完成设计后，David Baker等人将把用户的计算能力引导到重要的设计问题中，例如开发HIV的疫苗。人类难以对付HIV的主要原因是HIV上的病毒衣壳蛋白（viral coat protein）—gp120，具有许多高度可变环。针对HIV的免疫反应倾向于瞄准这些可变区域，因此相对来说不能起到有效的反应。然而，gp120上具有一些关键的区域是不可变的，因为它们是HIV侵染所必需的。研究小组中的Bill Schief与NIH(National Institutes of Health)D的Peter Kwong等人的研究小组合作，设计了一系列的新型蛋白疫苗来模仿这些HIV的不可变区域。

这些例子仅仅是开始。蛋白设计的潜力就好像生物学自身的多样性一样。具有创造未有的催化剂，改进生物分子的相互作用，和设计新的有用蛋白的能力后，剩下的事就仅受想象力和计算能力所限制了。（以上内容来自华盛顿大学HHMI研究员David Baker）（生物通：亚历）

References

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