siRNA设计系列文章：

siRNA 的设计(之一)

RNAi：制备siRNAs的5种方法——如何选择最适合你的方法

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应

利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA

PCR产物直接转染细胞并转录siRNA诱导RNAi

用RNase III制备siRNA库来诱发RNAi

如何设计出理想有效的siRNA是RNAi研究及RNAi技术应用的一个重要方面，甚至可以说是决定性的一个方面，然而一直以来，想要获得目的基因最佳敲除效果进行siRNA序列设计是一件吃力不讨好的事，但是随着RNA干扰技术的进步，以及各家生物技术公司的重点关注，一些siRNA试剂盒也呈现出了有针对性，系统化过程等简便siRNA设计的特点。

比如Ambion（RNA部门已被ABI收购）的Silencer™试剂盒等能够通过PCR获得siRNAs序列簇，并且一旦这些序列被扩增出来，PCR cassettes就可以直接转染进细胞系中，这样就能判断这些siRNA(s)中哪一个能获得最好的敲除效果。

这种技术的原理主要在于siRNA表达框（siRNA expression cassettes，SECs)，这是一段PCR产物，包含启动子、发夹结构的siRNA模版（hairpin siRNA template）和终止序列，当PCR产物转染到细胞后，发夹结构的siRNA模版被转录，得到的发夹siRNA被加工并诱导特异的基因表达沉默。

siRNA表达载体需要经过克隆和测序，这可能需要1—2周的时间，如果已知siRNA有效，这番克隆是值得的，因为只有载体上的siRNA才能持续表达，但是如果有很多siRNA筛选，这么艰苦的克隆和测序就非常费时费力了。siRNA表达载体由于Size比较大，转染效率不高，而且细胞必须在有抗生素压力的条件下培养来维持siRNA的表达，对于一些敏感细胞就无能为力了。而SECs能够在一天的时间内制备，转染方便高效，无需抗生素筛选，无需克隆和测序，能有效的节约时间，因而成为一种非常有效的筛选siRNA的工具，或者是鉴定不同启动子和不同的siRNA序列之间最佳搭配的筛选工具。应该说SECs是siRNA表达载体的完美补充，通过在SECs两端添加酶切位点，在实验中找到的高效SECs就能够立即被克隆到质粒中，从而得到siRNA表达载体，从而进行稳定和长时间的RNAi研究。

这种方式虽然对于siRNAs筛选以及细胞系转染十分方便，但是如果研究人员希望进行体内siRNA传送，那么在确认了最佳的siRNA序列之后还要选择一个病毒传递系统。目前有几种病毒系统，都具有高转染率。如何选择这些系统主要是看各人的实验需要，腺病毒不能整合到细胞基因组中去，但是能进行瞬时表达，而慢病毒（Lentiviruses）和逆转录病毒（retroviruses）则能整合到基因组中去，进行稳定表达。另外腺病毒和慢病毒系统可以用于感染分裂细胞和非分裂细胞，但逆转录病毒系统只能用于感染分裂细胞。

以下是一些受关注的产品：

1. BLOCK-iT™可诱导慢病毒RNAi系统
（BLOCK-iT™ Inducible Lentiviral RNAi System）

——这一来自Invitrogen公司的RNAi重要工具的一大特点就是允许在任何细胞系中调节表达，包括难于转染的细胞系和不分裂的原代细胞系。

厂家：Invitrogen

产品号：K4925-00

试剂盒反应数：20 reactions

启动子：H1

产品描述：

• 高效长期RNAi分析——有效的慢病毒整合
• 易于重组U6框-att位点使得从U6入门载体的转移快速和简单
• 高效的慢病毒转染-为动物模型、难于转染、原代和不分裂细胞提供可重复结果

这种BLOCK-iT™ Inducible H1 Lentiviral RNAi系统可以在任何细胞系中调节表达，这主要是由于其载体可以在任何细胞中进行可诱导RNAi，这个载体包含一个四环素严谨调节的H1/TO pol III启动子，没有四环素时，在表达四环素抑制子的细胞中，RNAi的基础水平非常低；在诱导时，会产生非常强的RNAi效应。

2.BLOCK-iT™ Adenoviral RNAi Expression System

——这一系统的重要特点就是可以在任何哺乳动物类型中有效的进行短发夹结构RNA（shRNA）的传送和瞬时表达

厂家：Invitrogen

产品号：K4941-00

试剂盒反应数：20 rxn

产品描述：

这种pAd/BLOCK-iT™-DEST RNAi Gateway® 载体可以在大部分哺乳动物细胞中效传送和瞬时表达短发夹结构RNA（shRNA）。其特点是，

• 快速、简单克隆shRNA序列-方便地筛选多个基因或者序列
• 经济——使用两个ssDNA 寡核苷酸（ssDNA oligos）
• 容易转移U6框（U6 cassette）到其它载体-att位点提供高效重组

3.Silencer™ siRNA Cocktail Kit (RNase III)

——有“RNA公司”之称的Ambion公司的经典之作，快速简便完成大批次RNAi实验

厂家：Ambion

产品号：1625

试剂盒反应数：20 rxn

产品描述：

制备siRNA需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA，但是这会带给研究人员繁重的重复工作，一种称为“混合鸡尾酒”的方法可以避免这些费时费力的工作，这种方法就是选择通常是200-1000bp的靶mRNA模板，用体外转录的方法制备长片段双链dsRNA，然后用RNaseIII（或者Dicer酶）在体外消化，得到一个许多siRNA的混合物，直接转染细胞，有效进行沉默实验。

Silencer™ siRNA Cocktail Kit利用的就是这个原理，可以有效的跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，Ambion曾利用Silencer成功沉默过包括c-fos，GAPDH，La，ß-actin和Ku-70。但是这个方法也可能会引发非特异性基因沉默，特别是同源或密切相关的基因。

4. GeneSilencer® U6-GFP PCR Kit

——无需克隆,可直接进行PCR扩增转染

厂家：Genlantis

产品号：P640300

试剂盒反应数：20 rxn

产品描述：

• $200可以进行20个siRNA序列的筛选
• H1和U6启动子确保了siRNA高表达量
• 可进行报告基因跟踪
• siRNA产物多样性，灵活性
• 无需克隆，快速简便体外siRNA表达

(生物通:张迪)