RNAi 5年回顾及在技术和临床的应用前景和市场分析[创新技巧]

【字体: 时间:2007年11月06日 来源:生物通

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  回顾5年来RNAi技术的研究进展、作为基因功能研究工具技术上的突破,RNAi技术在临床的应用前景之研究热点。

    1998年Andrew Fire和Craig Mello等人首次证实双链RNA分子可诱导同源目标mRNA降解,导致特定基因表达沉默,并将其命名为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。2001年Tuschl,Phil Sharp等人在Nature上首次证实哺乳动物细胞中也存在RNAi机制,并指出长度为21-25 nt的siRNA瞬时转染体外培养的哺乳动物细胞能诱导RNAi,但并不启动细胞凋亡或者干扰素响应。Tuschl提出21bp、3’末端带有2个碱基突出的siRNA(正符合Dicer酶切产物的特征)最有效。如果说2001年权威期刊《Science》10大突破之一的“RNA新功能”中提及RNA干扰现象,算是一次暂露头角的前奏,那么RNAi真正大放异彩成为“主角”则是在2002年——siRNA当选《Science》2002年度10大重要突破之首。打那之后,5年来,RNAi研究和应用达到了前所未有的新高度——从RNAi机制原理、RNAi技术在基因功能研究领域的应用,乃至临床应用等众多领域都有大量突破性成果涌现——RNAi已经成为基因功能研究和基因治疗研究等领域的最热门技术之一,仅仅在首次命名RNAi的8年之后,Andrew Fire和Craig Mello因此荣获2006年诺贝尔生理医学奖。
 
1. RNA干扰机制研究----生物体内广泛存在的RNAi作用是什么?
(1)病毒防御
    RNA沉默被认为是低等生物和植物抗病毒防御系统的一道防线,2002年5月《Science》的一篇封面文章将这一范围扩大到了动物领域:加州大学里弗塞德分校的Shou-Wei Ding等人首次证明动物细胞也利用RNA沉默来抵御病毒侵染,这也是首次为证明动物和植物王国抗病毒通路的高度保守性提供了实验证据。之后法国科学家进一步将这一范围扩大到了哺乳动物。2006年Eugene Koonin等人又证明原核生物里存在类似于真核生物RNA干扰系统的RNA沉默机制。

(2)基因调控
    多年来DNA和蛋白质一直是基因组研究中的主角,而RNA只是被看作来往与DNA和蛋白质间的信使而已。然而越来越多的证明表明了RNA的重要作用。在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子micro RNA (miRNA)。这种内源性的小分子RNA针对3’端非编码区,有着极高的保守性,并在组织中广泛表达,可在转录后以及翻译水平上调控基因表达。有人推测siRNA实际上不过是外源或病毒的dsRNA闯入内源RNAi通路的结果而已。寻找这类调节分子及其靶基因已成为研究的热点。2005年White head和MIT的研究人员发现miRNA调节着成千上万个人类基因,这些基因所占比例超过基因组蛋白编码区域的三分之一。这首次证明了miRNA影响着很多的生命功能。在解开miRNA如何影响生物体发育的这一未解之谜的道路上,Gaul等人证明了miRNA调节着许多发育中基本的过程,包括身体形态、形态发育学、神经系统和肌肉的发育,尤其是对细胞存活意义重大。另一方面,David Bartel等人发现在植物中存在的miRNA也控制发育过程中的基因表达。
 
    2005年《Nature》的一篇综述“Gene regulation:expression and silencing coupled”中提到,RNAi不仅可以通过促使mRNA分解以进行转录后调控,而且RNAi也在另外一个基因调控的过程——染色质的修饰中扮演了重要的角色,这一过程主要是通过控制组蛋白甲基化等修饰来实现的。这说明了RNA干扰的一部分作用机理:由于只有在DNA未折叠的情况下基因才会表现,因此miRNA凭借甲基化等修饰组蛋白而影响局部DNA的折叠,从调控大区域的基因表现,在发育及分化的过程中扮演了极为重要的地位。miRNA所诱发的染色质修饰需要RNA polymeraseII的参与,而也就说明了这种凭借甲基化染色质来抑制基因表达的过程,可能也是需要先转录成RNA,然后制造siRNA以进行染色质的修饰,抑制基因的表达。

    2006年David Corey还在Nature Chemical Biology发表文章提出siRNA不单可以沉默目标基因的表达,在某种情况下还可以激活目标基因的表达。同年的Sicence上发表了第一个Dicer酶的晶体图片,“dsRNA结合部分和RNAse III类似结构部分是分开的,中间间隔一个带正电的平台,可以容下25bp的RNA”,为解释Dicer到底如何加工siRNA提供一些线索。

    Alexander Murashov等人则发现外周神经也能内吞siRNA并在轴突中运输siRNA,能检测到轴突本地蛋白表达的下降。随后又发现在外周神经损伤或者脊柱神经损伤后的某些时间点有特定的miRNA产生,表明RNAi机制在神经细胞修复过程中可能起某些作用,RNAi甚至可能应用于脊柱神经损伤的治疗。
2006年冷泉港实验室Gregory Hannon等人发现了一类关闭基因表达的新小RNA分子----Piwi-干扰 RNA,大量存在于老鼠和人的睾丸中,科学家相信,与piRNAs有关的Piwi基因在多种生物中负责调控精细胞的发育和维持。这被《Science》评为2006年十大进展。
 
2. 技术应用
    了解基因的功能才能获得相应的专利以及由此带来的巨大经济利益,在全基因组测序已经不是难题的今天,如何能尽快从已经公布的测序结果中挖掘出基因并研究得到其功能,是当今最受关注的难题。由于可以方便快捷的临时关闭特定基因的表达,从而研究由于目标基因关闭而导致的变化,进而推测该基因的功能,RNAi技术已经迅速成为研究基因功能的利器。从2001年《Nature》杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后,RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。

(1) 基因沉默工具
    Tuschl在2001年Nature的文章提及,只有21-25nt,带有3’突出末端和5’磷酸化的siRNA才是有效的siRNA,其中以21nt效果最佳。这成为之后的siRNA设计法则“Tuschl法则”。
原有的siRNA转染技术只能达到瞬间的基因失活作用,2003年Shunsuke Ishii等人构建了一个新RNAi载体表达shRNA即短发夹RNA (short hairpin RNA)。这种方法既避免了引起干扰素应答,又允许组织特异性抑制基因表达。这个载体被命名为pDECAP,标志着RNAi转基因技术取得重大突破,这一新系统可作为传统小鼠基因敲除技术的一个有效替代方法。

    同年Rubinson DA等在 Nature Genetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞,干细胞和转基因小鼠都取得了RNA干扰成功,更大大扩展了这项技术的应用范围。

    2005年M. D. Anderson癌症中心的研究人员利用逆转录病毒将shRNA传递进一个小鼠的乳腺癌细胞系中,永久性沉默了活化形式的STAT3基因。同年Rossi等人发表文章提出27个碱基的siRNA作为Dicer底物进入RNAi途径,在很低浓度下(50pmol-200pmol)效果比21nt的siRNA更好更稳定。这个结论推翻了Tuschl原来认为25nt以上的siRNA不能作用的说法。27nt siRNA从此进入市场。不过研究人员同样指出,由于27nt 的siRNA需要经过Dicer酶切,所以不适于目前的修饰方法,否色无法被Dicer酶切。2006年Dharmacon则发表文章指出27mer siRNA可能引发潜在的IFN响应而质疑其应用前景。但是27bp siRNA依然受到关注,并且与Rossi实验室合作的Integrated DNA Technology公司技术负责人之一的Mark Behlke表示后继的体内实验中27bp siRNA表现出色。

    2006年Finkel等人在Journal of Immunological Methods发表文章,联合了三种技术——细胞核转染技术(nucleofection,利用专门的溶液和电脉冲临时开启细胞核膜,以便外源核酸进入细胞核中,是Amaxa公司的保密技术,Finkel本人将此技术描述为“就是一个黑盒子”,但是相当有效)、靶向HIV生存相关的HALP基因的siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)悬浮的人类T细胞进行了操作---旨在阻断和消灭已感染HIV的T细胞。不过,为将来在临床上得到应用,Finkel转用慢病毒来进行针对感染HIV的T细胞研究。
获得能够区分出等位基因的siRNAs一直是RNAi应用的一个难题,2006年Phil Zamore等人在PLoS Genetics上介绍了如何设计siRNA使得其可以识别存在单个SNP的等位基因,并强调了第16位碱基在识别单碱基多态性的目标序列时的重要性,提高了siRNA作为潜在药物治疗由单碱基变异而引起的遗传疾病的可能性。此外,由果蝇胚胎裂解物构成的“无细胞RNAi系统”也为RNAi的研究提供一种新的途径。

    2006年Dharmacon公司在《Nature Methods》上发表的文章首次证明了基因沉默中的“脱靶效应("off-target effects" ,OTEs)”主要原因是siRNA反义链的“Seed  Region”( 反义链2-7核苷酸序列)活性所引起的;因此,单独对正义链的失活将无助于降低脱靶效应。在《RNA》上发表的文章再次提出23bp以上的siRNA,特别针对27bp-29bp的Dicer底物可能影响细胞活力,并引发潜在的IFN响应,特别是dsRNA受体(Toll-like Receptor 3)的显著上调,引发对27bp Dicer底物在科研和临床的应用前景的质疑。

    同年Eriks Rozners提出以蛋白质氨基肽键代替siRNA中的磷酸二酯键骨架,得到具有蛋白质结构特征的siRNA,预期这种修饰会增加siRNA稳定性和对核酸酶耐受性,且减少的负电荷有助于分子穿越细胞膜进入细胞,增加的疏水性有利于运输蛋白的运输。此研究得到NIH为期5年的资助,并吸引的RNAi研究市场巨头Dharmocon的格外关注。

(2) RNAi文库

    随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开展,我们的视野不再局限于单个的基因,整个研究领域都在期待呼唤更为强大的、全基因组高度的基因功能研究工具。RNAi文库(RNAi library)是人工构建的能通过诱导沉默众多不同基因表达的组合文库,可以用于建立功能缺陷(loss of function) 的生物或细胞库,进行表型的筛选。

    2003年《Science》杂志上一篇文章利用RNAi筛查Hedgehog通路关键的细胞信号传导级联反应有关的数千个果蝇基因,这是RNAi技术首次成功用于筛查如此多的基因。

    2004年美国国家环境卫生研究中心建立了集中研究与环境健康和毒理学有关基因的RNAi库;2005年发表于《Nature》上的两篇文章利用Ambion公司的RNAi产品完成了当时siRNA文库进行的最大规模的筛选,确定了210种不同的涉及内吞作用的人类激酶。同年PloS报道了利用RNAi文库对线虫进行筛选得到的延长寿命的克隆,鉴定了23个与长寿相关的新基因。

    2005年Dharmacon公司(现ThermoFisher公司一员)完成世界上第一个完整覆盖人类全基因组的短干扰RNA(siRNA)文库。之后Open Biosystems公司于9月也宣布完成了覆盖小鼠全基因组的含有microRNA(shRNA(mir))序列的RNAi产品。

    2006年美国国立癌症研究院(NCI)的Louis Staudt利用RNAi技术对弥散性大B细胞淋巴瘤进行2500个基因的“功能缺失”RNA干扰筛查,找到一个新的对某一B细胞淋巴瘤亚型有效的潜在治疗位点。这个方法也为寻找癌症治疗新位点开拓有用的思路。文章发表在Nature上。
通过病毒载体能构建出含有不同基因的shRNA表达文库,这有利于长效抑制靶基因,突破转染技术的限制。2006年Stephen Elledge、Brian Cullen等人利用细胞内源RNA干涉机制构建了shRNA第二代文库。

3. 临床医药应用
    RNA干扰技术的发展一日千里,迅速从实验室研究向临床应用方向挺进,而且进展令人惊叹----目前已有4个产品进入临床试验,最快的今年底将进入Ⅲ期临床试验,预计在2010年左右会有一个真正意义上的RNA干扰药物成功上市。这对于生物技术行业是一个极大的刺激——自从20世纪七八十年代基因重组和单克隆抗体技术之后的二三十年里,虽然时时有新的生物技术如基因治疗、反义核酸技术、生物芯片受到追捧,但最终都是希望落空,整个行业都在期待新的有突破性应用前景的生物技术出现;另一方面,新药研发近年来屡屡陷入投资稳步增长,效率低下,周期延长,失败率增大,而新产品逐年减少的“怪圈”,制药巨头们纷纷寻求能够成为下一个“重磅炸弹”式药物的新型候选化合物,而RNAi技术具有吸引力的一个特点是药物开发速度比传统药物开发技术快得多,而且功能强大,因而很可能成为万众期待的候选者。

(1) 疾病治疗   
    2002年《Genes & Development》的一篇文章发现人类脆性X染色体综合征中的智力低下蛋白在果蝇中存在的形式与RNA干扰(RNAi)通路的构成有关,这说明脆性X染色体综合征的分子机制可能与RNA干扰相关过程有关联。

    同年著名的《新英格兰医学杂志》文章报道认为RNAi有望成为治疗艾滋病病毒HIV的新策略。MIT的Novina最早利用RNAi来对付HIV,开启了利用RNAi治疗病毒性疾病的先河。Novina与哈佛大学Shankar教授合作,试图利用RNAi来治疗AIDS。他们的研究成果发表在2002年7月的Nature Medicine上。不久哈佛的宋尔卫博士和Shankar继续RNA干扰HIV方面的研究,并利用RNAi进行体内抗HBV研究.。Ramratnam等人则致力关注RNAi用于防疫----在粘膜表面的靶向CCR5的siRNA是否能阻断HIV传播途径。

    2004年Beverly Davidson首次利用包装入病毒载体中的小分子RNA对有遗传疾病的小鼠进行治疗。这一成果提高了RNA干扰技术能够运用在人类临床试验上的可能性。

    美国费城Acuity制药公司(Acuity Pharmaceuticals公司)应用RNA干扰技术开发出的第一个RNAi药物Bevasiranib即将诞生。2004年Bevasiranib首获FDA批准进入I期临床。2006年9月, Bevasiranib在一项有129名湿性老年性黄斑变性(AMD)患者参与的II期临床试验中大获成功。试验表明,以siRNA为基础的Bevasiranib能够减缓眼睛中致病性血管的生长并能改善视力,应用最低剂量的患者维持治疗效果达到了数月时间,而接受最高剂量的患者其治疗效果一直维持到研究结束,更重要的是除了药物注射部位发生红肿之外,没有观察到其他任何副作用。Bevasiranib的Ⅲ期临床试验有望在2007年底启动,并于2009年获得最终试验结果。

    2005年Sirna治疗学公司(Sirna Therapeutics)宣布实现了RNAi应用于治疗中的重大突破,成功抑制了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)在人体内的95%的表达。此公司原来叫Ribozyme,后来乘机改名为Sirna,目前他们开发治疗ADM的RNAi药物Sirna-027已经进入I期临床,其他方面的应用如治疗Huntington病和哮喘以及COPD也进入临床前研究阶段。

    Alnylam Pharmaceuticals也在进行RNAi药物的开发,其股东正是1993年Nobel医学和生理学奖的获得者Phillip Sharp,他们开发的RNAi药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等。
同期中国旅美生物医学博士陆阳等人以及之后的Intradigm Corporation公司两篇《Nature》子刊文章证明了siRNA剂对恒河猴SARS冠状病毒(SCV)呼吸道感染能起到预防和治疗作用。2006年《Nature》更是公布在RNAi治疗研究的一大突破:研究人员沉默了一个猴致病基因,这是首次在非人类灵长类动物中有关RNAi的全身用药(systemic administration)研究。

    Mary Crowley医学研究中心的John Nemunaitis已经开始探讨将RNAi技术引入癌症治疗的个性化治疗方案中。由于疾病的个性化差异,一种新的药物或者方法要通过FDA是相当困难的。对于个别病例中某些已知过表达的基因而导致的癌症,RNAi关闭癌症基因的表达将是很有前途的工作。

    然而,利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题:(1)给药,也就是siRNA导入和定向的问题,如何使用高效载体定向传递siRNA到目标细胞而不影响其他无关细胞,甚至包括在释放时间上的控制;(2)siRNA稳定性,包括修饰或者用递送试剂包埋等方法提高或者控制siRNA稳定性;(3)安全问题。

(2)产业投资和专利
    各个生物技术公司在RNAi技术领域的竞争日趋激烈,德国的Ribopharma公司是第一个获得siRNA沉默基因专利的公司,Sirna和Alnylam公司拥有使RNA分子保持稳定的重要专利,Intradigm等公司主要研究其他能包裹siRNA进入细胞的分子载体,而Dharmacon、Qiagen以及Ambion则占据了RNAi实验试剂市场,Acuity有治疗老年性黄斑变性的药物即将进入III期临床试验。

    RNAi技术具有吸引力的一个特点是药物开发速度比传统药物开发技术快得多,RNA干扰技术已经吸引了许多大型制药公司的投资。RNA干扰技术发现者刚获得诺贝尔奖的当月(2006年10月),默沙东以11亿美金抢先收购了前面提到的Sirna Therapeutics,购得该公司100%的股权,这是一家拥有2个药物上临床试验、50个专利、250个专利申请案,覆盖几百个疾病和基因的新药研发公司。今年7月5日,阿斯利康和一家RNA干扰技术公司英国Silence治疗公司达成类似交易,涉及4亿美元的技术合作及转让。7月9日,罗氏制药与前面提到的美国Alnylam制药公司签订了一项价值高达10亿美元的协议,而此时Alnylam公司市值才不到6亿美元——Alnylam公司自2002年成立以来,凭借其在RNAi治疗领域的技术领先优势,已向包括Dharmacon、Sigma-Aldrich、Invitrogen等14家公司进行了专利授权,早在2005年诺华制药就已经收购了Alnylam公司19.9%的股份。
  
    一些制药业巨头如美国雅培制药、辉瑞制药这样的生物技术巨头也开始投入RNAi的研发,各大制药厂商纷纷抢夺治疗性RNA干扰技术的相关专利,以尽快占据市场制高点,令这一领域近来变得越来越炙手可热,预期这不仅能引起新一轮的RNA干扰技术应用大赛,,而且能加快新型RNA干扰药物成功上市以及扩大适应症范围的进程。

    这些激动人心的发现呼唤着一个崭新的RNA时代的到来,谁能抢先一步获得这科学上的圣杯,其所作出的贡献必将留于生物学研究的史册上。你,做好准备了吗?来吧!

全文链接:《RNAi 5年回顾和技术宝典》

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