哺乳动物细胞RNAi实验：siRNA的设计[心得点评]

    前面说过，哺乳动物细胞导入30bp以上的长双链RNA（dsRNAs）往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，所以不能用体外合成长的dsRNA直接导入细胞。常见的做法之一是直接制备19—27bp左右的siRNAs，然后再将siRNAs转入哺乳动物细胞。
 
    siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。虽然siRNA设计法则在不断地完善，可是并非每个设计出来的siRNA一定能有效沉默目标基因的表达，也没有办法100％预测设计出来的siRNA是否有效，所以设计出来的siRNA都必须经过实验证实。

    直接购买已经证实有效的siRNAs，好处是已经厂家荧光定量RT-PCR预证有效，无需设计、合成和验证，无需顾虑siRNA是否有效，便于研究人员把全部精力集中到目标基因功能的研究上，而不需要花费在其他地方——在全球科学家争分夺秒抢夺基因功能研究成果和专利的今天，时间就是金钱，为什么要把宝贵的时间和精力浪费在反复琢磨如何设计和验证siRNA上呢？除非你立志成为siRNA设计专家。

    专业的设计，高质量的合成和纯化，往往只需要很低的浓度就可以达到不错的基因沉默效果，也有助于减少脱靶等非预期反应——需要特别说明的是大多数siRNA不能达到100%沉默基因表达的效果----毕竟不是基因彻底敲除，只是在转录后水平降解mRNA，再加上siRNA转染本身很难保证100%的细胞被成功转染，未转染细胞在检测时也会影响结果----以RNAi试剂领域两大领先厂家Ambion和Qiagen为例，他们把能降低目标基因表达70%以上的siRNA称为有效，也有些公司的标准更高，如Bio-Rad标准是减低目标基因85%的表达，Dharmacon和Sigma标准则是75%。siRNA算是非常高效的，只需很低的浓度就可沉默基因表达，达到有效浓度后再增加也不会提高基因沉默的效果，反而研究结果表明过高浓度的siRNA（超过100nM以上）还有可能导致非预期的脱靶反应。所以在实验中，通常就需要摸条件，以有效的最低浓度为最适浓度以期减少非特异反应。

    因此在购买现成的siRNA，同样的包装量，有效工作浓度不同，每次使用的成本就不用，比如Bio-Rad的27bp siRNA保证工作浓度是5nM，Ambion的保证有效的最高工作浓度是30nM，多数厂家是100nM，如果是荧光标记的siRNA工作浓度通常达到100nM。假设同样的量，就算Bio-Rad的27bp siRNA比100nM工作浓度的其他品牌siRNA产品贵上20倍，二者每次实验使用成本也是一样的！因此，在考虑价格和包装时也要同时留意其有效工作浓度，才好比较价格。当然也需要同时考虑评估标准是用哪种细胞株。以Qiagen的资料为例，其验证siRNA用于Hela、A549细胞工作浓度为5nM足够，用于HepG2、HEK293、MCF-7细胞则需要用到25nM。

    虽然很多厂家如Qiagen等都在持续进行siRNA验证工作，以满足更多研究人员的需求，但是毕竟预证有效的siRNA还是有限的，如果你的基因并不在此范围内，你也可以选择

1. 厂家设计定制----只要提供基因的信息，即可由厂家设计合成纯化，还可以按要求修饰和标记。多个厂家提供NCBI的RefSeq数据库中已有的人类，大鼠或者小鼠的全部基因的siRNA定制合成服务，生物通在后面会介绍。对同一个基因通常需要设计3-5个不同的siRNA以保证其中至少2个siRNA是有效的，同时可做相互对照。同一基因定制多个siRNA，相比设计合成单个siRNA，厂家也会有“套餐”优惠

2. 自己设计再叫厂家合成----如果研究对象不在此列，也可以采用网上免费的siRNA在线设计工具来设计，生物通在随后附录一些在线工具的地址以供参考。不过，别指望用不同的设计工具对同一序列设计一定会得到类似的结果---不同的在线工具有不同的设计法则和评分标准，同一序列用不同的在线工具设计得到的结果也可能各不相同

    生物通ebioTips 6：好的实验设计应该至少选择2个以上针对同一目标基因的有效siRNAs同时平行做实验，以相互验证实验结果确实是由于目标基因沉默而引起的，并非个别siRNA的特异现象。严谨的实验态度是可靠结果的保证。如果未知是否有效，针对同一个基因选择3-5个siRNA平行实验是非常有必要的。自03年以来，不少文章从浓度、siRNA作用机制上阐述了导致脱靶反应的原因，这种平行对照更加显得必不可少。

1.各品牌商品化siRNAs 比较：（节选）

全文链接：生物通ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾及技术宝典》