Qiagen：预证siRNA特点[新品推荐]

Qiagen作为siRNA市场的领军人物之一，siRNA产品雄霸天下。特点是什么呢

    Qiagen自从几年前收购了全球知名的RNA合成厂家Xeragon，凭借Xeragon在RNA合成领域的雄厚技术实力和声望，成功进军siRNA合成领域并迅速取得了领先地位。利用BIOPREDsi法则进行设计，Qiagen的HP Validated siRNAs正在进行全球最大规模的siRNA验证工作，已经得到验证的有超过2000多个人类基因的3500多个有效siRNAs。每个siRNA都经过至少4次独立转染，每次双份的转染实验从而得到8个基因沉默效率的数据，每次独立转染都必须经过比较同一个正对照(MAPK)的基因沉默效率（70%以上为有效）进行每次转染效率间的平衡、荧光定量RT-PCR同时检测目标基因和。经过和未转染细胞之间的比较，得到的数据经过ΔΔCT 和管家基因GAPDH作为内参进行平衡，定量PCR还要通过实验排除污染，引物二聚体，引物发夹结构的影响，甚至连每个目标mRNA的溶解曲线也进行监控。这样得到最后能满足沉默效率在70%以上的siRNA才能被保留入选。这样严格的产业标准是一般实验室所无法实现的。现在Qiagen开放提供详细序列信息，每个siRNA 5nmol报价Y4678，按照去年价格战的折扣，不到3000。Qiagen网站上还有FlexiTube订购组合，一次订购4个以上，每个siRNA 1nmol价格90美元不到，以如此严谨的评估标准得到保证有效的siRNA，这个价格性价比颇高。1nmol大约相当于13-15ug siRNA。

    已经验证的siRNA毕竟很有限，各厂家还有一种由厂家根据用户目标基因，提供设计合成服务的Pre-designed 的siRNA，虽然没有验证，但是经专家设计，并经过严谨筛选，成功率高，也很省事----对于研究基因功能的研究人员来说，集中精力专心研究目标基因的功能，尽快发表研究成果才是主要目标。以Qiagen为例，提供针对人类，小鼠，大鼠几乎全部基因的siRNAs设计合成。所有设计的序列都经过严格筛选：
----筛选最新基因组同源序列，以避免脱靶反应；
----SNP筛选以避开SNP位点，
----干扰素结构域分析：已知一些结构域会引发干扰素相应，包含这些结构域的siRNA要被剔除。Hornung et al（.Nature Medicine 2006）研究表明免疫细胞，特别是浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells）内吞siRNA后会分泌I型干扰素。作者还鉴别了9个碱基的结构域特别容易引发IFN-I分泌。所以，如果siRNA会进入血液就要特别小心避免这类结构。
----3'UTR seed region分析：有文章表明，某些siRNA反义链的seed region(反义链的的2-8个碱基)和一些非目标mRNA的3'非编码区不完全匹配（imperfect matches）时有可能导致脱靶反应，使得非目标mRNA也发生降解。原因是这种siRNA可能模拟一个miRNA作用。Qiagen的设计会对RefSeq数据库中人类大鼠和小鼠的3'UTR序列和siRNA seed region的互补性进行分析，并尽量避开潜在可能出问题的序列。（生物通编者注：完全避免这种imperfect matches很难，并且匹配并非意味必然会导致问题出现。只是在筛选过程中尽量避免潜在可能出问题的序列。）

     这种Pre-designed siRNA单个报价不便宜。不过由于一个基因通常需要3-5个siRNAs同时平行实验，Qiagen提供的FlexiTube GeneSolution一次订购4个不同的1nmol的Pre-designed siRNA，总价格不到300美元，价格直逼国内siRNA合成价格，加上著名厂家设计合成，还是有吸引力的。Qiagen还有提供一种根据已发表文献公布的siRNA序列合成的商品，如果自己能找到文献也可以直接合成。Xeragon独有的TOM RNA合成专利使得合成siRNA纯度90%以上。（节选自：生物通ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾及技术宝典》）