siRNA设计法则和免费在线工具一览[心得点评]

siRNA设计法则和免费在线工具一览

    市面上已经有人类、小鼠和大鼠的全部基因的siRNA可售，以及五花八门的各种基因siRNAs，生物通小编正在整理有关数据，并准备将整理好的相关数据放在生物通商城中便于大家检索，工作正在进行中。。。尽管如此，还是有更多未开垦的处女地----对于没有已知有效的siRNA的基因，就只能自行设计和定制合成siRNA。如果，不巧，你的实验找不到现售或者已知有效的siRNA----实验不巧会麻烦一点儿，不过也说明你有机会得到前人没得到的结果，说不定更幸运呢！只是动作一定要快哦！

siRNA设计
    siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。只是国人习惯了免费软件，愿意为软件或者实验设计付费的真不多，宁愿自己辛苦点。。。所以，生物通小编总结了部分成功经验以供参考。还有免费的在线设计工具－－。

生物通ebioTips9：如果是自行设计siRNA的话，一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。

生物通ebioTips10：siRNA的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNAse会切除末端的G。

生物通ebioTips11：多个siRNAs位点最好分散分布在mRNA全长上。没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50－200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。

生物通ebioTips12：避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ，和其他基因有16个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。

生物通ebioTips13：GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有较多选择时留意。不要有连续9个以上的GC。也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISE上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5'端以GC开头，且5'端1－4个碱基GC含量高，且16－19位碱基GC含量低的序列得到的siRNA反义链5'端GC含量低3'GC含量高（也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISE，因而基因沉默效果比较好。

生物通ebioTips14：如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN（19），后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中j减出现连续的U/A。

    免费siRNA在线设计工具：这里介绍的有知名厂家提供的免费设计工具，也有来自学院派研究人员自行设计公开的在线工具。生物通前面也提到，不同的在线设计工具采有不同的设计法则，而这些年来这里设计法则还真不少，各不相同----显然没有哪个设计工具或者设计法则是完美的----既然有这么多免费工具可用，你总归会想都尝试一下，将自己的目标序列分别用不同的在线工具设计，期望得到相近的结果，似乎更有把握些----别指望太高，同一目标序列用不同的法则设计得到的结果很可能各不相同。很难说哪个比较好，哪个不好。实践是检验真理的唯一标准（汗，我现在才发现以前死记硬背的政治课不是白学的）。
芝加哥大学的Anne Cahill这样说：“我比较喜欢采用siSearch 网站来设计shRNA.。我喜欢是因为它可以根据一些列公开的设计标准返回一个评分。我并不相信某一个网站或者某一类设计法则是完美的，我曾经试过8个siRNA设计网站，输入同一个序列，希望找到一致的目标位点，不过结果令人绝望。所以我不会仅仅盲目的选择siSearch评分最高的的序列，我会尝试其他标准比如预测反义链二级结构和和目标mRNA上的定位，同时再看看RNAi Consortium或者RNAi Codex有没有我的目标序列。”
以下列出了部分著名厂家的免费在线siRNA设计工具-----（节选自生物通ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾及技术宝典》） 谢绝转载