延时蛋白质组学（Time-Lapse Proteomics）
     ——利用同位素标记和质谱技术，我们能够追踪蛋白质组动力学

许多目前的实验研究都是关注于单个蛋白或蛋白与其最临近分子相互作用的动力学研究，这尽管能够提供重要信息，但对于细胞来说，只是管中窥豹只见一斑。而定量蛋白质组学（quantitative proteomics）也只是获得虽然日渐全面但是依然是静态的研究成果。要想全面的了解细胞，获得细胞全貌，我们还需要进一步掌握整个蛋白质组相互关系和动力学特征。

来自德国Max Planck研究所生物化学系Matthias Mann等人将大规模定量蛋白质组学与延时细胞培养技术（time-labeling cell cultures）相结合，获得一种纵览细胞“全景”的方法，可以推断生长因子信号途径中的酪氨酸磷酸化^[1]，描述细胞亚结构——核仁的活性^[2]，还帮助研究人员绘制体内磷酸化蛋白质组（phosphoproteome）^[3]和核仁内相互作用网络^[4]。该方法与传统显微技术结合，能够提供代谢刺激时，蛋白质组成的动力学变化的更全面信息。正如美国国立卫生研究所Tom Misteli说的，“该方法的妙处是能够帮你全面观察动力学（特征）”，“这类方法对获得模拟细胞行为的数据十分重要。”

时戳（Time Stamping）

Mann在其早期工作基础之上，结合稳定同位素氨基酸的体内标记策（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC），获得了时戳（Time Stamping）法。SILAC原理是用三种精氨酸中的一种与各种碳、氮稳定同位素标记的赖氨酸标签培养细胞。Mann将三种精氨酸培养基培养的三批细胞的蛋白质组合成起来，利用质谱分析数据，根据每批细胞的质谱的静差（offsets）鉴别细胞中的肽段。因为三批细胞是在同样的条件下被分析的，它们的蛋白水平可彼此定量。通过对这几批细胞进行不同时长的刺激，Mann可以测量蛋白的相对水平，研究时间的功能。“这是首次对一个蛋白质组的时间进程进行观测。”

实时跟踪蛋白质组的技术都需要处理数量庞大的成分和各种成分的高动态范围，通常含量很低的信号通路蛋白更是难以跟踪。2003年，Mann打算对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号途径的动力学进行量化，新设备与其实验室研制的软件结合，为其提供了实验所需的精确性和敏感性。

为了弄清生长因子信号途径的动力学特征，Mann利用EGF，在不同时间间隔下，刺激同位素标记的细胞，再利用质谱分析联合裂解酶（combined lysate，生物通编者译）。在所发现的80多个酪氨酸磷酸化受体中，许多蛋白在之前的研究中是没有发现与EGFR信号途径有关的，只有1/3的受体在信号转导中发挥直接作用，很多与细胞骨架重塑（remodeling）有关。还有几种RNA结合蛋白有意想不到的活性。“细胞在向核仁传递信号时，尽力发挥RNA结合蛋白的活性，”Mann说，“这些在生长因子信号传递领域被忽略了。”

核仁动力学（Nucleolar Dynamics）

2002年，Mann与之前在苏格兰敦提大学的同事Angus Lamond利用SILAC，绘制核仁中几百个蛋白的图谱^[1]。在Mann利用SLIAC描述EGFR动力学特征成功后，他与Lamond应用延时技术研究抑制rRNA转录对Hela细胞核仁的影响。如果核仁如之前预测的那样，只是制造核糖体亚基的瞬时结构，那么抑制rRNA转录会导致核仁坍塌，但研究结果显示的却是另一番景象。核仁中有RNA加工因子和外切酶体（exosome）等多种蛋白，rRNA转录受到抑制时数量下降，但小核核糖体蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs）的数量上升，Coilin蛋白上升了10倍。Lamond说，很明显，核仁不是一个瞬时结构。

后继实验中，Lamond和Mann研究核仁内蛋白质转换（protein turnover），发现进入核仁的蛋白要比理论上生产核糖体亚基所需的蛋白多很多。Lamond说：“核仁除了制造核糖体亚基外，还有很多工作”（文章尚未发表）。去年，有介绍核仁蛋白相互作用图谱的文章，引用了Lamond和Mann的数据^[4]。

Lamond和Mann利用SILAC研究核仁蛋白质组的工作，与利用传统荧光显微技术进行的小规模测量匹配得相当好。Lamond说，这种“双策略”正在成为细胞和有机体系统生物学研究的核心方法。Misteli说：“这两种方法的联合，作用越来越大，能够应用到任何细胞生物学研究。”

Mann研究小组已经用这种延时方法研究丝氨酸和苏氨酸磷酸化，于2006年绘制出体内Hela细胞的磷酸化蛋白质组（phosphoproteome）^[3]。图谱显示了2244个蛋白上的6600个磷酸化位点，并描述了生长因子刺激时，它们的瞬时动力学特征。目前，已经可以从Phosida 数据库获得图谱， SwissProt 和 International Protein Index 数据库获得相关数据。伯克力分子科学研究所Orna Resnekov（研究酵母信息素信号转导）评价说，Mann的方法可以扩展到各种蛋白质信号途径，为该领域的研究人员提供了一种捷径。（生物通：小粥 责编：王蕾）

[1] B. Blagoev et al., "Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics," Nat Biotechnol, 22:1139-45, 2004. (cited in 113 papers) | [PubMed]
[2] J.S. Andersen et al., "Nucleolar proteome dynamics," Nature, 433:77-83, 2005. (Cited in 113 papers) | [PubMed]
[3]J.V. Olsen et al., "Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks," Cell, 127:635-48, November 2006. | [PubMed]
[4] A. Hinsby et al., "A wiring of the human nucleolus," Mol Cell, 22:285-95, 2006. | [PubMed]
[5] M. Mann, "Organellar proteomics," The Scientist, 18(7):32, April 12, 2004.