RNAi实验用户手册中文版(II)[选购宝典]

如何进行siRNA文库筛选？

如何挑选siRNA与筛选文库？

病毒转染的小发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）文库问世，使高通量哺乳动物细胞siRNA文库进一步成熟。虽然开发商不断地对二者进行改进和完善，比对起来比较困难，但还是可以看出商业化的siRNA 不如生产shRNAs的载体系统的沉默效果持久，但比较稳定，需要的工作量也小。

siRNA

商业化的siRNA

商业化的siRNA是进行快速、粗略筛选的不错选择，发展时间长，各个公司为研制、确定有沉默功能的序列已经投入了大量资金。哈佛大学医学副教授William Hahn 说，如果你有一个适合转染的细胞系并且分析时间相对短期的话，siRNA是一个非常好的途径。

siRNA的效果可以持续几天到一个星期。某些公司还合成小发卡结构，但所有合成结构都存在一个共同问题：HELA细胞或HEK293细胞容易转染，但原代神经元培养、造血细胞或者T细胞则需要载体。某些公司正在研制载体库，目前已经可以获得理论阶段的设计版本。

优势                                          劣势
• Well-validated                               • 价格昂贵
• 沉默效率高（75％）                           • 不能感染某类细胞
• 可靠                                         • 短期沉默
• 容易设计                                   

商业化文库
• Ambion
有小鼠和人类的沉默子siRNA库
人类：7800/9100个基因
小鼠：6400个基因
每个基因有3或4个siRNA（依文库而定）
价格：2千－10万美元

• Dharmacon（Thermo Fisher提供）
siARRAY and siARRAY RTF
人类：21500基因
小鼠：16500基因
每个基因有4个siRNA
28个初步设计的文库

• Invitrogen
Stealth™ RNAi essential druggable collection
人类：2400基因（17个基因家族panel）
小鼠：1300基因（4个基因家族panel）
每个基因有3个siRNA
价格：5千－4.9万美元/panel

• Sigma Aldrich
Mission siRNA Library, mouse and human
6600基因（17个基因家族panel）
每个基因有3个siRNA
价格：5千－5万美元/panel

• Qiagen
FlexiPlate siRNA 和 HP siRNA
小鼠和人类：17000个基因
大鼠：6千个成药基因（druggable genes）
每个基因有4个siRNA
价格：1 nmol ：50美元
      0.1nmol ：22美元

esiRNA

德国马克斯普朗克研究所分子生物学研究人员Frank Buchholz与其同事设计出一种运算法则，预测预测每个基因上沉默效率最高的基因域（the region on each gene with the highest density of efficient silencing triggers，生物通编者译），然后放大这些区域并为其标记抗菌素启动子，得到dsRNA，接着用RNAse III或者重组DICER剪切长链，得到一组内源RNase制备的siRNAs（endoribonuclease-prepared siRNAs，esiRNAs）。这种方法得到的esiRNAs与单链siRNA相比，脱靶效应下降了13倍。

优势：据报道，比合成siRNA效率高
劣势：不能感染某些细胞
      短时间沉默

可获得的文库
• 德国Resource Center for Genome Research (RZPD)提供的PCR产物（www.rzpd.de/products/esiRNA/）
•  Buchholz实验室目前正打算将esiRNAs商业化
•公布在RiDDLE数据库种的探针序列（http://cluster-12.mpi-cbg.de/bioinformatics_group/RiDDLE.html）
生物通报道：接上篇siRNA文库研究进展

shRNA表达文库的沉默效应持久。Aleister Saunders在Drexel大学的RNAi资源中心早在两年前购买逆转录病毒shRNA文库，“与siRNA相比，每个基因的成本非常低”，不足之处是不如合成的有效。

这种新的基因组文库采用的是慢病毒（lentivirus），慢病毒与一般的逆转录病毒不同，不仅可以感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞（采用慢病毒需要生物安全等级为2或2＋的设备）。二者的差异存在于是做Arrayed screen还是做 Pooled screen。Arrayed screen能用于图像分析（比如，敲除特定基因后纺锤体形态变化），以及探测显型中的小变化。Pooled screen需要的试剂少，成本小，但很难进行负面筛选（negative screens）。

Hannon-Elledge 文库

由哈佛大学医学院Stephen Elledge和冷泉港实验室Greg Hannon创建，用户可以购买到逆转录病毒（Psm2）和慢病毒（pGIPZ）载体版的文库。在早期内源性micro（mi）RNA序列出现后，Hannon 和Elledge构建出他们的shRNA文库，载体的关键是一个编码RNA的30-mer序列和Pol II（而非III）启动子的关键。根据Elledge实验室的研究，shRNAmir’s 的敲除效果更好，这对Pooled screen实验非常重要。  

             

优势
• Barcoded适合Pooled screen
• 有慢病毒和一般逆转录病毒两种载体
• MicroRNA发展潜力大，适合单拷贝

劣势
• 浅覆盖（Shallow coverage，生物通编者译），有些基因只有一个发卡结构

可用文库
• pSM2逆转录病毒 人类：85000 constructs target

                      31000 unique accessions
• pSM2逆转录病毒 小鼠：65000 constructs targeting

                      28000 unique accessions
• GIPZ逆转录病毒 人类：38287 constructs targeting 

                      28000 unique accessions
• GIPZ逆转录病毒 小鼠：33600 constructs targeting 

                      21000 unique accessions
• 由Open Biosystems发布

 

The RNAi Consortium（TRC）文库

由剑桥Broad 研究所支持的一家公私合作协会创建，起初用于Arrayed实验。理论上，发卡结构本身可作为barcode。据协会主任Sabatini说，研究小组正努力为pooled实验整理文库。

TRC关注基因的深度（depth）——每个基因至少有5个不同的shRNA。作为一家拥有广阔资源的大型公共机构，TRC打算利用文库中的每个发卡结构。              

优势
• 深覆盖（Deep coverage，生物通编者译）——每个基因有5个shRNA

劣势
• 无barcodes，不适合Pooled screen
• 只有慢病毒载体

可用文库
• TRC 慢转录病毒 人类：75883 constructs targeting

                      18200 unique accessions
• TRC 慢转录病毒 小鼠：65800 constructs targeting

                      15000 unique accessions
• 由Open Biosystems 和Sigma-Aldrich发布

荷兰癌症研究所的文库（NKI）

NKI文库是第一个投入使用的文库。NKI分子致癌物研究小组带头人Rene Bernards说：“许多鉴别相互作用分子的文章都利用过我们文库（资源）。”与Hannon-Elledge文库相似，NKI也利用baicodes做pooled screens，但其覆盖的人类基因只有TRC文库和Hannon-Elledge文库的一半，并且建成后没有升级过。“我不会改变一支胜利的队伍，” Bernards说：“我有H1 RNA载体工作。”许多研究人员注意到重组问题，Bernards说文库已经通过重组抗性载体进行了再次克隆。                      

优势
• 最长的跟踪记录
• Barcodes 适合 pooled screens

劣势
• 版本旧
• 只有逆转录病毒
• 覆盖较浅

可用文库
• 对人类：24,000 constructs targeting 8,000 genes
• 对小鼠：30,000 constructs targeting 15,000 genes
• 与荷兰癌症研究所合作获得
• 据Bernards说，英国剑桥Geneservice即将对其进行商业化
（生物通：小粥）

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