编者按：His Tag融合蛋白是为了后继的亲和纯化顺利进行。可是尽管有相同的亲和纯化标签，表达出His Tag蛋白后的依然存在困惑：如何筛选最适缓冲液条件？如何进行后继的放大纯化？GE Healthcare公司特别提供本文给出经典范例。
(His)6-NuRR 1蛋白在His MultiTrap FF 96孔过滤板上进行缓冲液条件筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。 对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时,将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实验结果展示对于该目标蛋白在25mM Tris,100mM NaCl, 10%甘油, pH8.5的缓冲液条件下是最佳的结合条件。 使用这个最佳的结合条件和两步纯化策略在AKTAxpress 上放大纯化目标蛋白。 放大纯化展现目标蛋白形成了单体,二聚体和三聚体。
简介
His MultiTrap FF 96孔过滤板常用于快速筛选和迅速平衡纯化His-标记的目标蛋白。在每一个孔中都预先填充了Ni-Sepharose 6 Fast Flow。 该填料预先偶联了Ni2+离子便于结合His-标记的目标蛋白。 本实验的目的是筛选(His)6-NuRR 1蛋白最适合的缓冲液结合和洗脱条件。另一个目的是使用筛选出的最佳缓冲液条件在AKTAxpress 放大纯化His-标记蛋白。
在His MultiTrap FF上进行缓冲液筛选
在His MultiTrap FF上进行筛选的样品缓冲液条件如图1所示。 缓冲液中NaCL浓度从100到750 mM, pH的范围在6.0到8.5, 甘油(5%到10%), 0.05%的还原剂, β巯基乙醇也包含在样品缓冲液中。(Fig1)
缓冲液筛选是由TECANTM Freedom EVOTM 200系统全自动的操作完成。
E. coli中表达的(His)6-NuRR 1蛋白被悬浮在两倍浓度的缓冲液中, 样品经过酶解破碎细胞,细胞碎片经离心除去,保留澄清的上清液。 将上清液转移到His MultiTrap FF 96孔板通常保温10分钟,之后将未结合的蛋白经过离心后收集。 His MultiTrap FF 96孔板用包含50 mM的咪唑缓冲液清洗,目标蛋白使用包含500 mM的咪唑缓冲液清洗。
在较低的pH下, (His)6-NuRR 1蛋白的结合较弱。 许多非特异的宿主菌天然蛋白结合较多。 在较高的pH条件下, 当甘油的浓度增加到蛋白结合量时, (His)6-NuRR 1蛋白的结合依赖于缓冲液中NaCl的浓度。 增加NaCl的浓度, 样品的结合等比例减少。 对于纯化(His)6-NuRR 1蛋白最适的缓冲液配比是25mM Tris, 100mM NaCl, 10% 甘油, pH 8.5(Fig 1)。
96孔过滤板: His MultiTrap FF
样品: E.coli表达的(His)6-NuRR 1蛋白
破碎/结合缓冲液: 缓冲液配比矩阵中含有1X BugBusterTM 蛋白提取剂,
25U/ml BenzonenaseTM 核酸酶,
1 kU/ml rLysozymeTM 溶液，
2X完全蛋白酶抑制剂，
Cocktail Tablet溶液
清洗溶液: 缓冲液配比矩阵中含有50mM咪唑
洗脱溶液: 缓冲液配比矩阵中含有500mM咪唑
SDS-PADE: 4到12% SDS梯度
使用AKTAxpress全自动进行(His)6-NuRR 1蛋白的两步纯化
使用在缓冲液筛选研究中决定的最适的样品缓冲液条件,在AKTAxpress上进行目标蛋白的两步放大纯化.
在纯化前,表达的(His)6-NuRR 1蛋白的E.coli细胞被破碎缓冲液匀浆。 破碎, 结合, 洗脱都使用25mM Tris, 100mM NaCl, 10% 甘油, pH 8.5缓冲液, 它是结合和洗脱的最佳缓冲液。 在结合和洗脱时,咪唑被加到基础缓冲液中（参照Fig2中缓冲液条件）。
在AKTAxpress上全自动进行纯化时，非澄清的E.coli细胞碎片直接上样到1 ml HisTrapTM FF Crude 柱上，目标蛋白通过与柱上固定金属离子的专一结合可直接纯化。纯化结果展示在该条件下（His）6-NuRR 1蛋白是一个单体，二聚体和三聚体的混合物（Fig2）。进一步的精细纯化使用16/60 Superdex 200pd凝胶过滤柱。收集样品的SDS-PAGE说明在AKTAxpress上纯化的样品纯度很高。
层析柱 HisTrapTM FF Crude 柱 1 ml
凝胶过滤16/60 Superdex 200pd
样品 非澄清的E.coli表达液
(His)6-NuRR 1蛋白
裂解缓冲液 25mM Tris, 100mM NaCl, 10%甘油, pH8.5
1mM TCEP, 20mM咪唑
25U/ ml Benzonase 核酸酶
1kU/ml r-赖氨酸酶溶液和2x全酶抑制剂
Cocktail Tablet溶液
IMAC结合清洗溶液 25mM Tris, 100mM NaCl, 10%甘油, pH8.5
1mM TCEP, 20mM咪唑
IMAC洗脱溶液合 25mM Tris, 100mM NaCl, 10%甘油, pH8.5
1mM TCEP, 500mM咪唑
凝胶过滤溶液 25mM Tris, 200mM NaCl, 5%甘油, 1mM TCEP, pH8.5
系统 AKTAxpress
结论
使用His MultiTrap FF 96孔过滤板可非常容易获得最适的缓冲液条件.对于(His)6-NuRR 1蛋白最适的缓冲液条件是25mM Tris, 100mM NaCl, 10%甘油, pH8.5。并将这一最适缓冲液条件应用到在AKTAxpress上的放大纯化。在放大纯化时， 将IMAC和凝胶过滤有机结合，成功地获得了三种形式的(His)6-NuRR 1纯蛋白。
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