解决蛋白鉴定中的瓶颈问题：SPOC靶板上样本制备技术[新品推荐]

  蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在蛋白质水平上进行研究。随着后基因组时代的到来，人类已经进入蛋白质组学研究阶段。

  科学家发现在实际样品中，蛋白质的丰度水平差异巨大，动态范围达1012现有的技术只能分析和鉴定约l／3的高丰度和中丰度的蛋白质，低丰度的蛋白质的分离和鉴定仍然是一个艰巨的前沿研究任务。另外一方面，翻译后修饰蛋白作为蛋白质组学的研究热点也越来越引起了众多科研工作者的兴趣。

  一般来说，对于低丰度或翻译后修饰样本的富集方法主要集中于对样品进行预处理。如采用抗体亲和作用来去除高丰度蛋白（如白蛋白、IgG等），或者利用层析方法通过馏分收集来低丰度样本进行初步富集。但是这些方法同时也存在着操作复杂、抗体种类、样本损失等缺陷。面对这个难题，QIAGEN公司在对蛋白/肽段在进行质谱分析前处理方面做出了不懈努力，利用SPOC靶板上样本制备技术，开发出新型的质谱靶板平台——Mass Spec Chip系列产品。

　　Mass Spec Chip由Mass Spec Focus Chip和Mass Spec Turbo Chip两类产品组成，前者专为低丰度蛋白以及磷酸化蛋白样本制备以及鉴定所设计，后者则主要针对蛋白/肽段的高通量质谱鉴定。Mass Spec Chip系列产品具有如下特点：

■灵活性好，可以适用于Shimadzu，Waters, Applied Biosystems, Thermo以及 Bruker公司的MALDI质谱仪。

■灵敏度高，比传统不锈钢靶板提高100-1000倍，最低能检测zmol级样本。

■操作简便，靶板上直接进行操作，无须样本转移，将损失降至最低。
  
一 Mass Focus Desalting Chip – 浓缩去盐型靶板

  Mass Spec Chip新型质谱靶板应用SPOC技术(Sample Preparation On Chip，靶板上样本制备)，此项技术集样本的富集，去盐，检测于一体。其原理是利用专利的疏水材料对靶板表面进行修饰。每个靶点由三个不同疏水性的区域组成（见图1）。疏水性大小为：分析区＜肽段亲和区＜边缘区。

图1. Mass Spec Focus Chip和Mass Spec Turbo Chip靶点结构图

  蛋白样本在提取，电泳分离，酶解过程中会引进盐分及变性剂的污染，尤其会影响低丰度蛋白的质谱鉴定成功率。传统去盐方法（如C18柱）操作过程繁琐且肽段的回收率低。Mass Spec Chip的操作体积为5-35 μl，远高于传统靶板的最大体积。利用Mass Spec Chip进行去盐时，当待分析的低丰度肽段点到Mass Focus Desalting Chip靶点上后，边缘区的强疏水性会使样本浓缩至亲和区，亲和区特异性结合肽段。盐类等干扰质谱鉴定的杂质在洗涤步骤中全部去除，最后加入基质和样本浓缩至分析区（见图2）。与传统的不锈钢靶板相比，灵敏度提高100倍，从而提高了低丰度肽段的鉴定成功率。

 
图2. Mass Focus Desalting Chip实验原理示意图

利用Mass Focus Desalting Chip可以去除诸如SDS，Urea等杂质及变性剂（见表1）。
            
表1Mass Focus Desalting Chip去除的杂质种类

Reagent	Concentration
SDS	Up to 0.1%
Urea	Up to 1 M
Guanidinium HCl	Up to 4 M
NaCl	Up to 1 M
Tris HCl	Up to 1 M

                                      

二 Mass Focus IMAC Chip – 富集磷酸化肽段靶板

  蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰。在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。固相金属亲和色谱（IMAC）法是近年来应用最广泛的特异性富集磷酸化肽段的方法，该方法适用于微量复杂样品的处理。

  QIAGEN公司将IMAC技术应用于质谱靶板从而推出了Mass Focus IMAC Chip，此类产品可以直接从靶板上富集磷酸化肽段。靶板上操作无需样品转移，最大程度的避免了样本损失，同时消除了非磷酸化肽段对于质谱信号的干扰。实验流程见图3，首先加入FeCl3溶液在亲和区形成IMAC层后，洗去多余的Fe离子。然后加入样品肽段溶液，IMAC层高特异性的结合磷酸化肽段，非磷酸化的肽段在洗涤步骤中被去除。最后加入基质和磷酸化肽段形成结晶进而进行质谱分析。

              图3. Mass Focus IMAC Chip实验原理示意图
 
  与目前已经在应用的各种富集磷酸化肽段的方法相比Mass Spec Focus IMAC Chip在磷酸化肽段的富集效率上具有独特的优势（见图4）。

 
图4. β-casin:ovabumin:BSA为1:1:10酶解后利用不同处理方法进行MALDI分析图谱
A spin-column based system B a gallium-based pipet tip system C a copper-based pipet tip system D a Mass Spec Focus Desalting Chip E Mass Spec Focus IMAC Chip

三 Mass Turbo Chip – 肽段/蛋白样本的高通量鉴定

     Mass Turbo Chip是一类预点CHCA或DHB基质的靶板，通量有192/1600等规格。适用于LC-MALDI MS 或2DE-MALDI MS的高通量鉴定。可成功鉴定zmol 级的样本。

  新型质谱靶板的应用
  新型质谱靶板利用SPOC技术，适用于蛋白质组学研究，新药研发，细胞信号转导以及生物标记物研究，如

• 低丰度肽段浓缩，除盐
• 磷酸化肽段的富集
• 高通量蛋白/肽段的鉴定

参考文献
1. SenseSensitive and reproducible detection of peptides by Maldi-TOF MS using self-assembled monolayer (SAM)-based chips – specifications and applications. Thorsten Jaskolla‡, Udo Roth*, Holger Rl*, Matthias Glückmann†, Michael Karas‡, Kerstin Steinert*, and Karsten Reihs. University of Frankfurt, Germany; *Qiagen GmbH, Hilden, Germany; †Applied Biosystems, Germany; Sunyx GmbH, Germany
2. New solutions for MALDI-MS sample prep provide high-sensitivity and high-throughput analysis. Udo Roth, Chris Belisle*, Julie Mirshad*, John Walker*, Irene Chen*, Karsten Reis, Holger Roehl, Guido Steffen, and Nick Sistig QIAGEN GmbH, Hilden, Germany; *QIAGEN Fremont Facility, Fremont, CA, USA
3. High-Affinity Sample Purification On Chip — Uses of IMAC Surfaces for the Purification of Phosphorylated Proteins with Detection by MALDI-MS. Christopher M. Belisle, Udo Roth*, Irene Y. Chen, Julie Mirshad, Christoph Menzel*, Kerstin Steinert*, John A. Walker II
QIAGEN Fremont Facility, Fremont, CA; *QIAGEN GmbH, Hilden, Germany
4. High-Affinity Sample Preparation On Chip — Uses of Reactive Surfaces for Immobilization of Biomolecules and Subsequent Purification of Samples for MALDI-MS. Julie Mirshad, Christopher M. Belisle, Irene Y. Chen, Udo Roth*, Kerstin Steinert*, John A. Walker II. QIAGEN Fremont Facility, Fremont, CA; *QIAGEN GmbH, Hilden, Germany
5. SPOC (Sample Preparation On a Chip) technology for the purification and concentration of engineered or phosphorylated proteins for detection by MALDI-MS. Christoph Menzel*, Christopher M. Belisle, Irene Y. Chen, Julie Mirshad, Udo Roth*, Kerstin Steinert*, John A. Walker II. QIAGEN Fremont Facility, Fremont CA; *QIAGEN GmbH, Hilden, Germany
6. Analysis of porcine peripheral blood mononuclear cells proteome by 2-DE and MS: Analytical and biological variability in the protein expression level and protein identification María Ramirez-Boo, Juan J. Garrido, Samuel Ogueta, Juan J. Calvete, Consuelo Gómez-Díaz and ángela Moreno. Proteomics 2006, 6, S215–S225