[创新技巧]肿瘤中的miroRNA标志

肿瘤中的miroRNA标志
George A. Calin 和 Carlo M. Croce
Nature Reviews, CANCER, volume 6, Nnovember 2006 

摘要：人类肿瘤的发生发展过程涉及microRNA（miRNA）的改变。与正常细胞相比，肿瘤细胞中许多miRNA都有表达差异。可能的原因如下：miRNA基因定位在基因组的肿瘤相关位点，表观遗传修饰，以及microRNA合成机制发生改变。对肿瘤miRNA表达谱的研究，已经得到了与肿瘤诊断，分期，发展和治疗效果相关的标志性miRNA。进一步的研究将寻找并确定新的miRNA靶基因，据推测，这些基因很有可能是激活的肿瘤信号通路下游的目标基因，或者参与肿瘤形成的编码目标蛋白的基因。

癌症是一种复杂的遗传疾病，涉及到编码和非编码基因在结构和表达水平上的异常。在过去三十年中，编码蛋白的癌基因和抑癌基因1-3被认为是肿瘤发生的原因。然而，在刚刚过去的几年间，发现了数千个新基因，它们没有明显的开放阅读框，与非编码RNA（ncRNA）转录本对应。因此，肿瘤细胞基因组的复杂性远远超出人们之前的预期。非编码cDNA常常有几千或几万个碱基，由于实验技术的限制，目前很难克隆，因此，对于长片段的ncRNA的研究进展缓慢4，但是，对于ncRNA家族的短片段成员的研究，最近取得了巨大的成功5-9。

这些microRNA(miRNAs)是小的非编码RNA，长度为20-22bp，通常是从60-110个核酸的发夹结构RNA前体剪接得到10-12。miRNAs的生物合成需要复杂的蛋白体系，包括Argonaute家族成员，依赖于POl II的转录机制，RNase III Drosha和Dicer13。miRNAs参与的重要生物学过程，包括发育，分化，调亡和增殖11-14，通过与靶mRNA非完全互补，在转录或转录后水平调控编码蛋白的基因的表达15-17。目前已报导的人miRNA（Sanger Institution于2006年7月发布）超过450个，是最初推算数量的2倍多19，还有超过1000个预测的miRNA基因20-22需要通过实验验证。

最初对miRNA表达变化的探讨来自于对B细胞慢性淋巴性白血病（CLL）的研究23，其后，众多研究小组在多种人类肿瘤中检测到miRNA的表达变化（文献24-34对癌症与miRNA的关联进行了探讨）。研究发现，miRNA既能起到癌基因的作用（如mir-155和mir-17-92簇），也能起到抑癌基因的作用（如mir-15a和mir-16-1），因此，miRNAs对肿瘤的发生发展有重要作用。对可能影响miRNAs表达的基因组水平异常的研究，得到了与编码蛋白的基因一致的结果，这些异常包括染色质重排，基因组扩增，缺失和突变。在特定种类的肿瘤中，蛋白编码基因和miRNA水平的异常都能被检测到29。编码miRNA的基因中，纯合突变或者同时发生突变和缺失的情形很少发生35，而肿瘤中发现的杂合子序列变异究竟有何意义，目前尚不清楚36。此外，目前正开展的研究还包括，靶mRNA互补序列多态性在肿瘤病人37，或者其他遗传疾病易感个体38中的作用，。目前的研究结果表明，肿瘤中，影响microRNA功能的主要机制是基因表达异常，表现为与正常组织相比，miRNA成熟体或前体序列的表达异常。

肿瘤和正常组织的miRNA表达谱
miRNA的寡核苷酸芯片是目前研究大量样本中数百种miRNA的肿瘤特异性表达的最常用的高通量方法（综述13，39，40）。以微阵列芯片为基础的miRNA芯片最早由Liu等开发。目前，世界上最为成熟的miRNA芯片是丹麦Exiqon开发的miRCURY™ LNA 芯片。该芯片已经推出8.1版，可以检测Sanger miRBase数据库8.1版中所有物种的全部microRNA。其中人的microRNA检测范围更达到Sanger miRBase数据库8.2版水平。此外，芯片中还加入近150个miRPlus™ 探针，能揭示数据库中尚未提供的microRNA信息。芯片采用LNA（locked nucleic acid）专利技术，极大的增进了捕获探针与互补的靶DNA或RNA的亲和活力，使芯片具有高灵敏度，高特异性等特点。另一种用于研究miRNA表达水平的方法是结合磁珠与FCM（流式细胞仪）的方法41（图1）。其他技术发展还包括针对miRNA前体42或成熟体的实时定量PCR43-44，miRAGE——采用基因表达系列分析（SAGE）法45在基因组范围内分析miRNA，或者是基于高通量芯片的Klenow酶检测法（RAKE）46。这些方法各有优劣，但是，在近年中，采用这些方法研究了超过1000种原发瘤，肿瘤中miRNA受到的抑制调控的趋势渐渐显现出来。

图1 用于分析miRNA表达水平的芯片和基于磁珠的FCM方法

miRNA表达谱可以对人类肿瘤分型
到目前为止，在被研究的每种肿瘤中，miRNA表达水平（包括前体/成熟miRNA）与相应组织的正常细胞中的表达水平都有显著区别（表1，图2）。现在，已经有采用两种截然不同的方法对不同肿瘤的全基因组miRNA表达水平进行大规模研究的结果发表41-47。

Lu等开发出一套特异性很高的基于磁珠的FCM方法，系统的研究了334例白血病和实体瘤，发现miRNA表达谱与谱系和分化阶段有关。进一步研究发现，每种肿瘤的基因表达谱反映了转化的不同机制。例如，急性白血病可分为三种，分别为BCR-ABL，TEL-AML1（急性粒细胞白血病1，或者是Runt相关转录因子1；RUNX1）和MLL（混合谱系白血病）重排，等等。一项有趣的发现是，肿瘤的miRNA表达水平普遍低于正常组织，在217个被检测的miRNA中，有129表现出这种表达模式。对此的一种解释是，miRNA的整体表达水平反映了细胞的分化阶段。实际上，包括Lu等和Garzon等的众多研究表明：不同的miRNA表达水平反映了造血细胞的不同分化水平。

表1 肿瘤中miRNA表达水平的部分研究成果
 
*表格中只包括了对人原发瘤的芯片分析结果

肿瘤中的miroRNA标志（2）

肿瘤中的miroRNA标志（3）