[创新技巧]肿瘤中的miroRNA标志（2）

肿瘤中的miroRNA标志
George A. Calin 和 Carlo M. Croce
Nature Reviews, CANCER, volume 6, Nnovember 2006 

摘要：人类肿瘤的发生发展过程涉及microRNA（miRNA）的改变。与正常细胞相比，肿瘤细胞中许多miRNA都有表达差异。可能的原因如下：miRNA基因定位在基因组的肿瘤相关位点，表观遗传修饰，以及microRNA合成机制发生改变。对肿瘤miRNA表达谱的研究，已经得到了与肿瘤诊断，分期，发展和治疗效果相关的标志性miRNA。进一步的研究将寻找并确定新的miRNA靶基因，据推测，这些基因很有可能是激活的肿瘤信号通路下游的目标基因，或者参与肿瘤形成的编码目标蛋白的基因。

 

Violinia等采用芯片分析了540个样本，包括来源于人类最常见的6种实质瘤的363个样本和177个正常组织，发现与正常细胞相比，肿瘤细胞的miRNA具有特定的表达谱47（图2）。在所分析的228个miRNA基因中，肿瘤细胞中有36个过表达，21个表达下调。分层聚类分析显示，根据miRNA标记，肿瘤组织能够根据其组织来源进行分类。除上述实验之外，针对不同的肿瘤进行的基因组水平研究还包括CLL49，乳腺癌50，胶质母细胞瘤51，甲状腺乳头状癌37，肝细胞癌52，肺癌53，结肠癌45和胰腺内分泌癌54。例如，通过比较104组配对的原发肺癌和正常肺组织，Yanaihara等发现43个表达有明显差异的miRNA，在肿瘤中下调的miRNA有28个，上调的有15个。Murakami等采用芯片平台对肝细胞癌进行研究，发现了8种表达有差异的miRNA，其中5种表达下调52。所有这些研究都支持同一种结论，即癌细胞的miRNA表达变化既有上调，也有下调。

图2 人实体瘤和体液瘤miRNA表达分析的实例

在研究miRNA表达变化时，一个关键的因素是表达变化达到何种程度才被认为差异具有生物学意义。在甲状腺乳头状癌中，10-20倍的表达差异被认为是重要的37。但是，有时候，差异小一些的表达变化也被认为是显著地（例如小于2倍的差异）35, 49-51。这是由于肿瘤中大量的miRNA表达出现差异，可能是特异的miRNA可以调控多种靶基因表达。据此可以推测，可能同时出现2个或多个协同作用的癌基因或抑癌基因表达受到抑制的情形29。与之相反的观点则认为，某些情况下发现的肿瘤和正常细胞之间的表达差异在生物学上可能是无关的变化：不同靶点间的综合作用结果可能是拮抗效应而不是累积效应（例如，对凋亡促进基因和凋亡抑制基因的抑制均发生）。

在不同肿瘤中， miRNA差异表达普遍存在，提示可能是一些共同的生物学通路受到调控。
通过两种统计学方法对芯片数据进行分析，这两种方法分别是微矩阵显著性分析SAM和微矩阵预测性分析PAM，共研究了6种实体瘤（肺癌，乳腺癌，结肠癌，胃癌，前列腺癌和胰腺癌）的miRNA表达。Violinia等的实验结果说明，存在一种包含21种miRNA的表达差异47的miRNA标记，其中的miRNA在至少3种不同类型的肿瘤中表达有差异。最明显的是miR-21，在6种肿瘤中均为过表达，miR-17-5p和miR-191在5种肿瘤中均为过表达。由于所研究的肿瘤的胚胎来源各不相同，这些发现的意义在于，这些miRNA参与了基本的信号通路，而这些信号通路在多种肿瘤中均发生变化。对于有明显表达差异的miRNA，预测得到的靶基因明显集中于已知的抑癌基因和癌基因47, 进一步证实了在肿瘤发生过程中，这些miRNA有重要作用。根据 Meng等的研究，miR-21，唯一一个在6种肿瘤中均过表达的miRNA，在恶性神经胶母细胞瘤55, 51和胆管癌56中同样过表达，并且在胆管癌细胞中，miR-21的直接靶点是抑癌基因PTEN。PTEN编码一种磷酸酶，抑制细胞生长或者细胞存活的信号通路。在多种肿瘤的晚期，包括乳腺癌，肺癌，胃癌和前列腺，PTEN的功能发生改变57。在所有这些肿瘤中，PTEN位点的杂合子缺失（LOH）很少发生，其频率<10%，那么，推测若在其他类型的肿瘤中也发现PTEN是miR-21的靶点，那么很有可能miRNA调控是造成PTEN失活的主要机制。此外，在培养的胶质母细胞瘤细胞中，使miR-21表达下调，激活了依赖于caspase的细胞凋亡途径55。所有这些研究显示，miR-21是抑制凋亡和促进细胞存活的因子。

F. Slack的实验室进行了一系列精彩的实验，深入研究了一些miRNA，这些miRNA在肿瘤中下调，并且靶位点是抑癌基因或癌基因。结果显示，Ras癌基因受到let-7 miRNA家族的调控58。Voorhoeve等同样在深入阐明miRNA功能方面做了出色的工作，其研究小组发现，在青少年和成年的睾丸生殖细胞癌中，miR-372和miR-373起到了癌基因的作用。在表达癌基因HRAS和功能性的野生型TP5359的细胞中，这些miRNA能促进细胞增殖和转化。

从转基因和基因敲除的小鼠模型中，同样得到了人类肿瘤中miRNA功能的证据。这对于研究表达下调的miRNA所参与的肿瘤形成途径极为重要。He等的研究表明，miR-17-92簇的增强型表达加速了MYC介导的淋巴瘤发生，说明在B细胞淋巴瘤中，由于基因组扩增而过表达的miRNA中，有部分可能是具有癌基因潜能。最近，Costinean等建立了第一只能够特异性在B细胞中过表达miR-155基因61的转基因小鼠。这个基因在多种恶性B细胞62-64中均过表达。转基因小鼠首先发生多克隆性前淋巴细胞和前B细胞增殖，随后则发生B细胞恶质化。根据结果推测，miR-155表达受到抑制是肿瘤发生的早期事件，若要发展出完全的肿瘤表型，还需要一系列后继的基因变化61。与之类似的还有对MYC癌基因的研究结果。MYC的激活是通过人B细胞瘤中染色体易位产生的65。在一种鸟类模型中，发生在淋巴瘤形成和红细胞白血病形成中的致癌协同作用，在非蛋白编码的BIC基因和MYC基因间被观察到，后来的研究发现，BIC基因区域包括了miR-155序列66，说明MYC和BIC在肿瘤中可能存在协同作用。对于从miR-155转基因小鼠中分离出恶质化的B细胞，进行芯片分析，通过与未转基因小鼠的B细胞对照比较，筛选出表达受抑制的蛋白编码基因的完整列表，并且可以进一步筛选出miR-155直接和间接的靶基因。特别要指出的是，在转基因模型小鼠的前恶质化细胞中，有16种不同的miRNA表达出现差异，说明在蛋白编码基因和miRNA之间存在复杂的联系，可能影响特殊的信号传导途径，并且可能miR-155和其他表达下调的miRNA之间也存在直接或者间接的相互作用。

致癌-miRNA和抑癌-miRNA：对同一个基因的两种不同认识？
基因组水平的研究同样为研究miRNA在肿瘤中的作用提供了新的思路和观念。第一种思路来自于O’Donnell在细胞模型中的研究。在人B细胞株 P493-6中，MYC过表达，而miR-17-92座位的miRNAs有抑癌活性，它们的表达抑制了E2F1的表达，并进一步抑制了MYC介导的细胞增殖67。然而，从B细胞淋巴瘤中得到的结论则有所不同。同样这一miRNAs簇，与MYC协同作用，并且抑制凋亡，因此又有潜在的癌基因功能， 60。一种可能的解释是，同样的miRNA参与了不同的信号通路，在细胞存活，生长和增殖等方面，由于细胞种类和基因表达模式的差异而有不同的效应。miRNA和mRNA相互作用的联合机制意味着同一个miRNA可能有多个不同的靶基因，而在不同类型的细胞中，同一种mRNA也可能受到不同的miRNA的调控。例如，Cimmino等发现白血病细胞内，若13号染色体上miR-15a和miR-16-1座位缺失，此时导入外源性的miRNA，则会诱发凋亡。导入的外源性miR-15a和miR-16-1与凋亡抑制基因BCL2相互作用，但在miR-15a，miR-16-1和BCL2都正常表达的293胚肾细胞中则没有这种效应 68。可能是B细胞中miR-15a和miR-16-1的缺失诱导了BCL2的过表达，从而引发B细胞恶质化。如果换一种组织，miR-15a和miR-16-1的过表达可能会造成某种抑癌基因表达的缺失，而这种基因对于生长控制和细胞凋亡十分重要。有一些研究结果支持了这种假设，在CLL病人的B淋巴细胞中，虽然miR-15a和miR-16-1表达下调23，但是，在神经外胚层来源的胰腺内分泌癌细胞中，同样的miRNA则为过表达47, 54。

第二种观点源于以下的发现：在多种不同肿瘤中发现，前体miRNA持续性的异常表达，但是有活性的miRNA分子表达水平并没有相应的变化42, 47, 49, 52, 53。Yanaihara 等在他们找到的43个miRNA标志中，发现7个miRNA前体在正常肺组织和肺癌组织中表达有差异。而Jiang等通过特异性针对前体miRNA的实时定量PCR发现，在32种肿瘤细胞系中，有9种miRNA前体的表达有显著差异69。这些研究提示，miRNA的“非活性”成分可能在肿瘤的发生中有独立的但目前尚不清楚的重要作用。可能的相互作用分子是RNA结合蛋白（例如，异质性细胞核核糖蛋白，hnRNPs），一类在所有肿瘤中表达均有异常的蛋白70。这些蛋白与RNA分子结合，调控其稳定性，因此，可能在多种miRNA前体中序列中存在hnRNA结合域。但是，目前尚没有直接证据证明其对miRNA前体的调控功能。

miRNA表达异常的原因
目前，对肿瘤细胞中广泛存在的miRNA表达变化只做了初步的研究，对不同肿瘤中miRNA的异常表达的研究汇总，将有助于在整体上阐明miRNA表达谱。目前，至少有3种不同的机制（可能相互独立，也可能共同作用）已经被发现。这些改变与特异性的miRNA基因异常表达相关，并可以部分解释这些表达变化。

MiRNA定位在肿瘤相关基因组区域（CAGRs）中
对miRNA家族成百上千个新成员的研究发现，其中半数以上的miRNA定位于已经证明在肿瘤中易发生改变的染色体区域内71。这些区域包括：最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中；最小扩增区域，可能包含癌基因；常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内，以及脆性位点（FRA）。FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点，例如，人乳头瘤病毒（HPV）。值得注意的是，miRNA位点与子宫内膜癌相关的致癌性HPV插入位置密切相关，据此推测人类基因组中病毒的插入可能会干扰ncRNAs的功能71。

图3 染色体水平上microRNA位点的改变

一些研究表明，这些计算机预测出的相关性对于miRNA的表达是十分重要的。Zhang等通过高分辨芯片兼容的基因组杂交（aCGH）方法，发现肿瘤基因组中miRNA位点变化的频率很高72。并且所研究的miRNA中大约有75%在成熟的miRNA和DNA拷贝数之间存在相关性，更为重要的是，这一结果与Iorio等在乳腺癌基因组获得的数据是一致的（分别有81%存在miRNA的扩增和过表达的一致性，60%存在miRNA缺失与表达下调的一致性）50。这种一致性其它的例子还包括，两个研究小组分别对13号染色体上的两个miRNA簇进行的独立研究结果（图3）。簇一为miR-15a-miR-16-1，定位在13q14.3，该区域在B细胞慢性淋巴细胞白血病和垂体腺瘤中缺失，通过northern blots检测发现在这两种肿瘤患者中多有miRNA的表达下调23, 73。簇二为miR-17-92，定位在13q31，在B细胞淋巴瘤和肺癌中该区域发生扩增，He等通过芯片实验发现相应的miRNA表达上调59，而Hayashita的研究小组和Tagawa与Seto则通过northern blots 在肺癌和恶性淋巴癌中检测到相应miRNA的表达上调74, 75。

肿瘤中的miroRNA标志

肿瘤中的miroRNA标志（3）