[创新技巧]肿瘤中的miroRNA标志（3）

肿瘤中的miroRNA标志
George A. Calin 和 Carlo M. Croce
Nature Reviews, CANCER, volume 6, Nnovember 2006 

摘要：人类肿瘤的发生发展过程涉及microRNA（miRNA）的改变。与正常细胞相比，肿瘤细胞中许多miRNA都有表达差异。可能的原因如下：miRNA基因定位在基因组的肿瘤相关位点，表观遗传修饰，以及microRNA合成机制发生改变。对肿瘤miRNA表达谱的研究，已经得到了与肿瘤诊断，分期，发展和治疗效果相关的标志性miRNA。进一步的研究将寻找并确定新的miRNA靶基因，据推测，这些基因很有可能是激活的肿瘤信号通路下游的目标基因，或者参与肿瘤形成的编码目标蛋白的基因。

miRNA表达的表观遗传调控

DNA整体甲基化水平低，CpG岛过甲基化和组蛋白修饰缺失是细胞恶性转化的表观遗传标志76。已有多个小组开始研究表观遗传改变是否会影响miRNA表达。Scott等对乳腺癌细胞的研究表明，抑制组蛋白的去乙酰化酶，随后miRNA水平迅速改变77。Saito等则发现，用5-氮杂脱氧胞苷（5-AzaCdR）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制物4-苯丁酸（PBA）联合处理膀胱癌细胞，对miRNA的表达有显著影响78。17个miRNA（芯片同时检测miRNA有313个）表达上调超过3倍，其中miR-127表达水平变化最大。这个miRNA定位在染色体14q32的一个CpG小岛中，该区域在血癌中多发生易位，在实体瘤中则发生杂合子缺失（LOH）71。此外，联合处理还造成miR-127的转录起始位点附近的DNA甲基化水平的降低和活性组蛋白标记的增加。研究者发现，miR-127在翻译水平上抑制锌指结构特异性的转录抑制基因BCL678的转录。因此，5-AzaCdR和PBA对肿瘤细胞的联合处理诱导了miR-127的表达，进而发挥肿瘤抗性作用，具体机制则是抑制抗细胞凋亡因子如BCL6的表达，进一步诱导细胞凋亡78。

DNA去甲基化和组蛋白去乙酰化对miRNA表达的影响可能具有组织特异性。对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞进行去甲基化的处理或者结合HDAC抑制剂进行处理，对miRNA表达水平没有显著影响36, 53。支持这一假设的理由还有，通过芯片分析，在正常肺细胞中未发现miR-127表达39，在癌组织和正常肺组织中也没有明显的表达差异53。

miRNA合成相关基因和蛋白的异常变化

miRNA生物合成所涉及的蛋白机制非常复杂。理论上，miRNA合成相关蛋白发生变化将对miRNA的表达有显著的影响34。实际上，在原发肿瘤中，Drosha的失效与miRNA的表达下调相关79。而Karube等对NSCLC病人的大规模研究中则发现，在部分肺癌中，是Dicer而不是Drosha的表达水平下调。这一发现与NSCLC患者手术后存活率下降和肿瘤低分化状态的结果一致，而后二者又与预后差联系80, 81。同样，NSCLC患者存活率下降和miR-155和let-7表达水平间也存在相关性53, 82。这些结果提示，患者的存活率低可能是miRNA生物合成和表达均发生异常的结果。条件型Dicer敲除的小鼠模型存在发育缺陷，包括肺上皮异常81, 83，但是，还没有在肿瘤形成方面的报道。向裸鼠注射Dicer缺失的胚胎干细胞也没有成瘤84。

编码小RNA合成的相关蛋白的基因若发生异常，其影响范围可能远远超出目前所发现的。最近，发现一类新的种系特异性小ncRNAs（26-31个核苷酸，命名为PIWI-interacting RNAs（piRNAs）），并发现它们能与睾丸特异性鼠PIWI蛋白直系同源物结合85-89。尤其引人注意的是，人类的这一Argonaute蛋白亚类的同源蛋白，命名为HIWI，定位在染色体12q24.33，而这一区域与青少年和成年人的睾丸生殖细胞癌发展密切相关。此外，HIWI在大多数睾丸精原细胞瘤中均为过表达90。胃癌的HIWI表达则与细胞增殖密切相关91。这些研究提示，piRNAs可能代表了肿瘤相关的小ncRNAs作用的另一种类型，特别是与PIWI过表达相关。

miRNA表达谱应用于临床

作为人类肿瘤信号通路积极的参与者，miRNAs对肿瘤的诊断和预后也有重要意义（表格1）。在前面所讨论的多篇文章中，在多种肿瘤中对这一点都有证明49, 50, 62。但是，也有其它的研究表明，当活体组织切片无法判断肿瘤类型时，miRNA可以被用来诊断。

作为诊断工具的miRNA表达谱

原发瘤位置未知的转移瘤（CUP）是目前诊断结果中10种最常见的肿瘤类型之一，在人类恶性肿瘤中的比例达到3-5%92。CUP病人出现多种转移（已经是癌症晚期），但是未发现原发瘤（也就是肿瘤发生的起始位点和转移起点）。Lu等的研究极大的推动了对这种奇特的肿瘤的诊断。分析了17种分化很差，没有明显的组织学特征的肿瘤，Lu等发现，为了对样本进行正确的分类，基于miRNA的分类方法比基于mRNA的分类方法更为有效41。这个发现激动人心，相比较于分析成千上万种mRNAs，只分析几百种miRNAs的表达能更有效的预测CUP。由于miRNA表达随着分化阶段发生改变，与作为对照的分化程度高的肿瘤相比，分化程度差的肿瘤，其miRNA表达水平整体偏低41。而分化程度差的肿瘤中miRNA表达水平整体降低可能就是通过miRNA表达水平可以有效诊断CUP的原因。

在西方社会，CLL是最常见的成人白血病之一93, 94。通常，这种疾病会发展成为恶性淋巴瘤或白血病，包括Richter综合症95。对于绝大部分CLL病例，预后相对较好，因此，只有在诊断中发现预后差的标记物才会开始进行治疗96。这样的标记物极少，在已经发现的标记物中，包括70kDa的zeta链相关蛋白（ZAP70）的高表达和免疫球蛋白重链可变区的突变缺失（IgVH）。通过对144个CLL患者的miRNA进行分析，一组特异性的13个miRNAs（共分析190个miRNA）可以做为标记，根据预后的好或坏，或者疾病恶化与否对病人进行区分35。在预后好的病人中，miR-16-1和miR-15a表达水平低，与早期的报道一致，即基因组13q14.3位点缺失的部分包含了与疾病时期相关的基因97。在预后差的病人中发现的表达下调基因，包括miR-29家族。这一结果可以由最近的发现解释，在疾病恶性期病人的CLL细胞中过表达的癌基因TCL1，是miR-29家族的靶基因（Y. Pekarsky，未发表数据）。这些试验结果提示了一种模型，存在两种CLL，它们的分子组成不同，并且临床特征相反：一种是染色体13q14.3缺失和miR-16-1和miR-15a表达量低型，预后良好，疾病进展缓慢；另一种是miR-29家族基因表达量低，TCL1蛋白表达量高型，疾病进展到恶性期，可能发展为Richter综合症。而CLL样本中BCL2总是过表达99，提示miR-16-1和miR-15a可能还有其他靶基因，这些基因与疾病进展密切相关；而BCL2表达下调的其它机制（例如，在少数病例中存在的BCL2易位100），以及其它与之相互作用的miRNA也可能参与其中。

作为预后工具的MiRNA表达谱

对全世界的男性癌症患者来说，致死率最高的是肺癌101。因此，发现新的预后标志物（即与疾病进展相关的标记）可以帮助对病人进行诊断，发现那些可以从高强度治疗中受益的患者。通过对104位美国肺癌患者的单变量分析，发现miR-155（高表达）和let-7a-2（低表达）的水平与病人的预后差相关；而多变量分析则表明，当考虑所有的临床变量时，miR-155的表达水平仍然与预后差相关53。在另一项对143位日本肺癌病人的研究中，发现let-7表达下调与外科治疗后存活时间缩短密切相关82。在以上两项研究中，2/3的病人是腺癌（NSCLC的一种）。通过多变量分析，let-7的低表达水平可以作为独立的预后标志进行疾病分期，并且与存活期显著缩短有关82。在一项对29项研究Ras癌基因在NSCLC癌症病人存活中的作用的荟萃分析中，发现Ras过表达与存活期缩短有关102。由于let-7对 Ras有负调控作用58，以上结果说明，在let-7，Ras表达和肺癌病人生命期之间存在联系。

癌症治疗中miRNA的应用前景

miRNAs在癌症中的应用目前尚在研究中。其理论依据是miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基因表达。而且miRNA表达谱在用吉西他滨治疗的过程中会发生；体外试验则证明，调控部分miRNA（如miR-21过表达）能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性56。这些结果为将miRNA作为治疗靶点提供了试验基础。经过修饰的miRNA在体内的半衰期更长，功效更久，例如LNA修饰的寡核苷酸103，抗miRNA寡核苷酸（AMOs）104和反义miRNA（antagomirs）106等是将基础研究的成果应用于临床治疗的起始步骤。未来，通过miRNA转基因和敲除进行的体内试验将为miRNA治疗的安全性和有效性提供有用信息。

肿瘤易感的新方式

从酵母到人的各个物种，基因表达水平都有自然的区别。这种特征又被称为“基因表达表型”，具有可遗传性，这一点在对人类进行的家族聚集性研究和对酵母中进行的单个种族隔离研究中都有发现106, 107。Cheung等采用芯片研究人的成淋巴细胞，发现了一组在不同个体间表达有较大差异的基因106。无关个体间的基因表达水平差异是同卵双胞胎的3-11倍，兄弟姐妹间的差异则为2-5倍。这些数据提示，个体间的基因组差异可能是造成部分基因表达表型差异的原因106。根据miRNA发挥功能的机制，通常miRNA的靶基因是一组有重要功能的编码蛋白的基因，推测若miRNAs序列或表达的差异通过生殖细胞遗传， miRNA可能到影响癌基因或者抑癌基因的表达水平，因此，miRNA与肿瘤易感性相关（图4）。

肿瘤病人中有特殊的一类，他们多是家族成员，患上相同或不同的肿瘤，但是没有发现明显的孟德尔遗传学特征。这类家族易感性是一个很大的医学难题，而对易感基因的识别，可以为早期诊断和对肿瘤的预防提供依据。虽然经过重重努力，这一易感现象的机制仍然是一个谜。一个研究得比较清楚的例子是家族性CLL：在某些家系中，有两个或多个成员出现CLL，发现存在共济失调性毛细血管扩张突变（ATM）108, 109或ARLTS1基因的突变110，也出现miR-15a和miR-16-1转录本的突变35，但对其他病例，真正的易感基因仍然是未知的。

在美国，非洲裔前列腺癌患者的比例与白种人患该病的比例不一致，遗传背景可能是一个重要的影响因素，但是经过了几十年的研究，仍然没有确定具体的靶基因111。一项研究分析来源于两个不同人群的18个前列腺正常组织样品，其中10个是美国的高加索白种人，8个是非裔美国人，样本来自与美国国立癌症研究中心合作的前列腺癌组织中心。采用了两种芯片结果分析方法，PAM和SAM，鉴别出在非裔人群中相比较于高加索人来说表达明显上调和下调的miRNA（(G.A.C., C.M.C., S. Volinia and S. Ambs, 数据尚未发表）。表达差异超过3倍的miRNA包括miR-301，miR-219，miR-26a，miR-1b-1和miR-30c-1。因此，对一个特定的组织，不同的人群显示出不同的microRNA表达谱。至于这种差别是不是具有家族遗传性，还需要进一步的试验说明。而研究主要是通过对遗传性高的癌症，如家族性乳腺癌或和家族性CLL等的大规模研究，确定相应的miRNA的表达谱。                                                        

结论
miRNA与癌症易感性的关系仍需进一步研究说明。但是无可否认，在多种不同类型的肿瘤发生和发展过程中，这些基因组的新成员参与了众多的信号途径的调控。

肿瘤中的miroRNA标志

肿瘤中的miroRNA标志（2）