蛋白质组研究中的化学“探针”[创新技巧]

蛋白质组研究中的化学“探针”

作者:郝运伟, 姜颖, 贺福初  

随着蛋白质组学概念的提出以及诸如血浆蛋白质组等有影响力的计划开展,  蛋白质组研究迅速发展起来,  这门基于分析化学和物理化学的领域也逐渐为广大生物学家所关注,  同时也相应地在细胞生物学、生物化学等领域的研究中崭露头角。蛋白质表达量的变化以及各种各样的修饰无不反映出机体对环境变化的应激和自身功能的需要。因此,  定量蛋白质组和修饰化的蛋白质组成为了目前蛋白质组研究的重要领域之一。文章着重从采用化学标记实现定量和修饰化研究这个角度来介绍近些年来在这方面取得的进展,  希望对生物学领域的研究有所借鉴。 

蛋白质组学是一门由技术发展而驱动的学科, 基质辅助激光解吸附解离, 电喷雾等软电离方式的出现以及串联质谱技术的发展不仅使蛋白质的测序变成可能, 而且在许多其他方面研究, 如蛋白质相互作用、蛋白质表达变化和蛋白质修饰等也大有作为[1]。

蛋白质组学研究的任务之一就是通过对蛋白质表达量的变化来探寻潜在的能成为疾病早期诊断的标志物[2], 首先曾被研究者广泛采用的就是双向电泳和肽指纹图谱技术[3], 而且后期出现的差异荧光显示技术大大提高了双向电泳技术的重复性[4], 但是由于双向电泳本身的局限性使得许多信息丢失掉。 另一方面, 蛋白质是生物体内功能的执行者, 而复杂的修饰则赋予了蛋白质更多的信息, 许多生物学过程, 如信号传递、蛋白质降解、细胞之间的识别等, 都是依据修饰后的信息来完成, 而且部分修饰后的蛋白也成为了疾病诊断的标志物[5]。因此对复杂的蛋白质修饰及修饰位点的研究业已成为蛋白质组研究的热点之一。随着液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)联用自动化程度的提高, 使得蛋白质大规模鉴定成为可能[6], 同时也弥补了双向电泳上的不足。不仅如此, 许多基于此的新颖的化学方法也开始出现百家争鸣的景象。就化学标记而言, 许多研究人员发展了不同的标记方式, 但根据标记物引入的阶段, 大致可以分为体内标记和体外标记两大类, 而后者又可分为酶解前标记、酶解时标记和酶解后标记这3类, 其中定量蛋白质组的标记策略可参考图1。

其主要思路是在原有蛋白质或肽的基础上引入一个在质谱中可以检测的修饰, 进而通过峰强度信息给出样品中蛋白质含量的差异。而针对修饰研究, 则通过化学方式来区别或富集这类的肽片段, 进而在质谱中找到修饰的位点, 尽管这类方法还没有广泛的被采用, 但已有的尝试性的探索也给人们留下了很多的思考空间。本文就着重讨论化学“探针”在定量蛋白质组学及蛋白质修饰研究中的进展和应用。

1 定量蛋白质组中的“化学标签”

所谓标签就是将可区分的因素引入所要研究的差异样本中去, 进而可在质谱分析时利用这类信息将样本间的相对量的差异区分并显示出来, 采用这样方式的研究主要有体内标记和体外标记两大类。

1.1 体内标记 体内标记也可叫做代谢标记, 主要是利用含稳定同位素的饲料或培养基来喂养动物或培养细胞, 从而实现差异标签的引入。目前较为常用的是N和C的天然稳定同位素15N和13C。

1.1.1 15N标记

15N标记可以说是一个比较简单的方法, 细胞分别生长在含15N和14N的培养基中, 细胞收获裂解后取等量蛋白混合并进行质谱分析, 即实现了定量比较。Oda等[7]就利用此法研究了酵母缺失体Ste20的蛋白磷酸化位点上的强度变化, 而且对所建立的体系给与了比较完善的评估, 是利用15N作为标记物的比较早的文章。 Wu等[8]在大鼠体内也实现了15N标记定量, 研究者给大鼠喂养含15N的细胞作为N源, 并系统的评价了标记的效率, 标记对大鼠的影响及标记数据的统计分析, 最后给大鼠注射放线菌酮来研究对蛋白合成的影响这个实验来说明大鼠体内标记在实际研究中的可操作性, 研究中鉴定了大量的细胞色素P450酶, 表明机体大多数蛋白合成被抑制的同时许多次生代谢和负责新合成蛋白错误折叠的蛋白浓度也相应的提高, 这些研究数据对15N标记做了很好的诠释, 但动物体内标记的唯一缺点就是周期过长。

1.1.2 13C标记

与15N类似, 13C同样也可作为培养基中的成分而掺入中去, Cargile[9]用13C的葡萄糖作为唯一碳源来培养大肠杆菌, 并采用质谱定量来研究了蛋白质在细菌体内的合成和降解情况。通过对标记和非标记肽段之间的比值以及13C分布的模型分析, 给出了计算代谢速度的公式, 最后作者以代谢速度较快的YfiD蛋白的生化功能作为模型给出了合理的解释, 说明了公式的可参考性。此外, Snijders[10]以噬热菌为模型同时联合了14N和13C作了代谢标记的分析, 培养细胞分别在13C作为碳源和14N作为氮源的培养基中进行培养, 通过在一级图谱上和未标记的蛋白比较可得到定量和元素组成的信息。研究人员在研究结果中表明利用元素组成分析不仅可大大提高蛋白鉴定确定性而且可以进行de novo分析。

1.1.3 氨基酸标记

氨基酸标记是将某一个氨基酸的碳原子或氢原子替换为其稳定的同位素, 而后再将这种氨基酸加入到缺陷型培养基中, 这样细胞就可将此种氨基酸掺入蛋白质中来引入标记。Mann的实验室首先报道了这种方法[11]并取名为SILAC(Stable Isotope Label-ing by Amino Acids in Cell Culture), 其后又系统的报告了这种方法的可行性和可靠性[12], 诸如完全标记所需要的时间、定量的误差置信区间、标记的动力学以及图谱的解析等, 而且能够实现数据批量化处理的软件也已公布在因特网上(http://msquant.sourceforge.net)。目前标记的氨基酸种类已扩展到亮氨酸、精氨酸和赖氨酸[11~13]等等, 所涉及到的研究领域也很广, 如EGF通路[14]、核仁的蛋白合成的动力学[15]以及干细胞分化[16]等, 这种方法可以说是一种很有应用前景的研究手段。

1.2 体外标记

尽管体内标记可以在很大程度上避免人为操作过程中可能引入的误差, 但是对于某些样本, 如临床样本就派不上用场。因此体外标记就显得必不可少, 体外标记可根据蛋白质鉴定的过程分为酶解前, 酶解时和酶解后标记。

1.2.1 酶解前标记

顾名思义, 酶解前标记是将差异试剂标记在蛋白质上, ICAT(Isotospe Coded Affinity Tag)就是这样一种技术, 该技术1999年由Aebersold的实验室报道[17], 其设计思路是将含有生物素基团并且质量差异为8 Da(主要由氢原子引入)的试剂分别通过巯基活性基团连接到蛋白质半胱氨酸的巯基上, 等量混合后酶解, 最后通过链亲和素的柱子富集这些标记的肽段, 以质谱分析差异。这个思路虽然巧妙, 但实际应用中却存在一些问题, 首先是在分子中含有一个较大的生物素基团(442 Da), 这样就会造成一些肽序列信息的丢失, 对于分辨率较低的质谱尤其明显。其次由于标有重氢的样品有保留时间的同位素效应, 导致同一蛋白不能共洗脱, 这样会造成离子化的不完全同步。最后生物素亲和提取仍然存在非特异性吸附的问题[18]。针对这些早期的问题, ABI(Applied Biosystems)公司对ICAT试剂做了相应的改进, 采用了可在酸性条件被切割的连接物, 从而可在肽富集后丢掉生物素这个基团, 而且采用13C替代了2H解决了液相分离时的保留时间不同的问题。Aebersold的实验室也在ICAT的基础上开发了固相同位素标记的技术[19], 该技术与ICAT相比具有快捷简便、肽回收率高、不受变性剂影响和标签质量小等特点。ICAT及其改进试剂在蛋白质组研究中应用很广泛, Ranish等[20]应用此技术定量的研究了转录起始复合体以及酵母中Ste12的组成问题。另外Han等[21]在这个平台基础上定量分析了在植物凝集素刺激下细胞的分化行为。

1.2.2 酶解时标记

蛋白质在内切酶作用下发生酶解, 溶液中的羟基和氢分别结合于肽的C端和N端, 形成新的羧基和氨基。Stewart[22]利用了这个反应将18O引入到酶解后肽片段当中, 形成了定量工具。研究者系统的分析了蛋白质在H2O16和H2O18中酶解的差别, 指出了18O作为比较定量标记的可靠性, 并在平台的基础上对ZipTip除盐及冷冻干燥过程做了肽回收率的分析。Yao等[23]也采用18O标记比较了两类腺病毒的蛋白质组成差异。

1.2.3 酶解后标记

有些标记试剂适用于在蛋白质酶解成肽段后标记, 除上面提到的ICAT之外, 还有MACT和iTRAQ, 现面就这两种策略作一介绍, MACT(Mass-Code Abudance Tagging)是由Emili实验室开发出来的[24], 其原理是对肽段上赖氨酸的ε氨基进行胍基化形成高精氨酸而引入特定质量, MCAT具有胍基化修饰的比较完全, 可进行从头测序, 质量标签可以很容易被质谱检到而且这种修饰不干扰肽的电荷和离子化性质等优点。 iTRAQ(Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents)是近些年发展出来的一个比较新的标记策略[25], 它有4种不同的分子量标记并可同时标记肽段的N端和赖氨酸的ε氨基, 这样大大丰富了鉴定肽段的信息量。同时该试剂还设计了平衡基团, 这样就不存在色谱保留不同的问题, 该策略的定量是发生在二级质谱阶段, 碎裂的肽段用来鉴定蛋白而标记的小分子用于定量。该方法的一个突出优点是可同时比较4个不同的样品, 而且加入的基团可提高肽段的离子化效率并丰富鉴定信息, 因此这个方法在体外标记中具有很大的应用潜力。

2 修饰化蛋白质组研究中引入的标记

蛋白质修饰一直以来都是蛋白质化学研究的领域之一, 质谱作为强有力的研究工具被应用以来, 蛋白质修饰的研究也就成为了蛋白质组学的热点之一, 目前在这个领域比较集中于对磷酸化、糖基化和泛素化的修饰上。

2.1 磷酸化

真核细胞内的磷酸化过程对于许多生物过程, 如代谢、信号传导等的实现是必需的。传统的磷酸化抗体检测和鉴定不仅得不到磷酸化位点信息而且在验证上也存在难度。但是采用MS/MS检测位点存在信号抑制、不易诱导解离和难以得到较高的覆盖率等问题。基于此, Knight等[26]利用了磷酸化丝氨酸在碱性条件下会发生β消去的这个事实, 采用加成反应使磷酸化的丝氨酸形成赖氨酸的类似物, 从而造成了酶切位点, 这个特殊的y离子即可在一级质谱图上显示出来, 这就实现了磷酸化位点的特异性鉴定。运用这个策略, 作者对G蛋白偶联受体激酶2和微管蛋白做了针对性研究, 发现了一些以前尚未报道的新的磷酸化位点。这个方法不同于以往的磷酸化肽的富集鉴定策略[27], 是一个很有开创性的工作。 除此之外, Ibarrola等[28]利用前面所提到的SILAC技术在磷酸化研究方面也做了比较新颖的工作。研究人员将磷酸化状态不同的细胞标记上不同的同位素, 而后根据一级谱峰强度的差异来判断肽段的修饰与否, 若有修饰则在MS/MS图b系列离子中寻找由于β消去而形成的脱氢丙氨酸(69 Da), 从而确定磷酸化的位点。作者以Frigg蛋白为例应用了这个方法, 从结果中很好的表明了这个方法的可行性。

2.2 糖基化

蛋白质的糖基化, 尤其是N连接的糖基化很普遍的存在于细胞外蛋白中[29], 如血浆蛋白、脑脊液蛋白和质膜外侧蛋白等。但是糖基化蛋白由于其复杂的糖链结构, 一直以来是研究的难题。Zhang等[30]用化学方式研究了这个问题, 首先对糖蛋白进行氧化, 使顺二醇基团变为醛基, 再采用双氢氯噻嗪将之固定在固相支持物上。洗脱掉其他非糖基蛋白后, 采用糖苷酶F释放肽段, 最后采用质谱分析。在这个方法中还可引入定量的标签, 即以含重氢的琥珀酸酐使赖氨酸上的ε氨基转变为高精氨酸从而引入标记。研究人员将这个方法分别应用于血浆和细胞表面的糖蛋白, 对血浆蛋白系统的研究表明该方法对糖肽的捕获非常有效, 定量准确而且可以大大降低血浆蛋白的复杂性。对细胞膜蛋白的分析也表明了这个方法的可靠和实用性。作者最后指出类似的方法也可应用于O连接的糖基化分析, 说明了这个方法的普适性。

2.3 泛素化

泛素化在蛋白质降解中起着重要的作用, 对泛素化过程的阐述也是2004诺贝尔奖的重要的内容。泛素化修饰发生在赖氨酸上, 经胰酶酶切后泛素分子仅剩两个甘氨酸连接在ε氨基上从而在赖氨酸残基上增加了114.1 Da, 而且胰酶无法在修饰后的赖氨酸C端形成位点, 故此该特性可在MS/MS中找到。但一直以来泛素化是一个研究难题, 这主要是由于修饰的分子量过大, 而且这种修饰转瞬即逝难以捕捉。Peng等[31]以泛素缺陷型酵母为材料, 将含有His标签的泛素化质粒导入, 再采用Ni-NTA亲和色谱来富集泛素化肽, 并在二级质谱中鉴定泛素化的位点。研究中共鉴定了1,075个蛋白, 其中发现了72个新的泛素连接, 并且找到了一些新的泛素多聚体的形式, 是目前泛素化工作中一个比较大的数据集。

3 总结与展望

蛋白质组学是一个不断发展的领域, 其中蛋白质化学在新方法、新思路的开创上发挥了很大的作用, 标记技术的不断涌现也说明目前的技术平台还不稳定, 需要进一步的拓展。

3.1 化学标记的优缺点和应用问题

如前文所述的定量标记可分为体内和体外两种, 体外标记技术可以分析的范围比较广, 从组织、体液到细胞样品都可以采用这类技术分析, 但它的一个比较明显问题就是标记效率问题, 由于标记在体外进行, 标记分子与蛋白质存在不完全反应的现象, 由于不同实验室技术体系的差别, 所以就需要用预实验来分析这个问题。

对于体内标记而言, 实现完全标记是可能的, 这主要取决于蛋白质的代谢, 故此在实验初期需要确定细胞的培养代数[12], 以便得到良好的标记。此外, 体内标记的好处不仅在于具有较高的标记效率, 而且还有利于分子生物学的开展, 因为标记本身是源于原子质量数的不同, 而对细胞本身没有任何影响, 但是由于体内标记的全套体系尚未商业化, 所以分析软件没有标准化, 目前只有Mann实验室提供了免费的软件(http://msquant.sourceforge.net), 这就为数据分析带来了一定的不便。此外, 由于不同实验室的设备和技术条件的差别, 所以对于任何一种标记定量实验而言, 都需要事先分析标记的动力学范围, 并确定合理的比值, 这样才能分辨实际样品中的真正差异变化, 否则会造成一定程度上的错误结论。关于定量修饰标记的研究, 叶雯等在文章中也有比较充分的描述[32]。

化学标记来分析蛋白质修饰是一个比较有前景的门类, 因为蛋白质的修饰和功能是息息相关的, 而且许多疾病的发生也和修饰有一定的联系。近期Mann[33]实验室结合稳定同位素标记和差异技术分析了EGF通路中磷酸化蛋白, 共分析了6,000多个磷酸化位点, 可以说是目前最具规模的磷酸化研究, 这与其实验室的技术储备和条件密不可分的。所以这类研究由于目前的技术条件问题, 仅有部分实验室有能力开展, 其主要的限制是用于特定标记的化合物的合成和高分辨率的质谱, 这也是当前没有在大范围内开展研究的原因, 所以目前此类研究还是比较集中于采用一些富集手段, 如亲和色谱等, 来得到磷酸化和糖基化等修饰的肽段, 而后在确定其位点, 但相信标记研究随着技术的发展和研究需求会蓬勃繁荣起来。 生物体内蛋白质的量化和修饰信息对于基因功能的认识是非常重要的, 因此蛋白质组中的定量和修饰研究将会不断进行下去, 这也会使目前的标记探针技术不断完善, 向更好的方向迈进。