新干细胞培养方法：两种膜的结合

　　

生物通报道：Clinic大学的研究人员证实，他们设计的一种新的成体干细胞培养方法能够使成体干细胞高效长成角膜干细胞。

 

眼科专家Ana Fernández Hortelano证实，这种培养技术已经成功用于治疗70只兔子的角膜疾病。该研究的目的是希望能够修复受损的上皮细胞并因此恢复角膜的透明。

 

这项研究证实了利用来自健康眼睛的角膜干细胞来治疗人的角膜病变是可行的。这项技术目前正在被用于人类患者，并且获得了满意的结果。

 

这项研究分为两个主要部分。一方面，该研究论文描述了一种新的细胞培养方法的设计，另一方面则证实了这个过程的临床应用价值。

 

两个阶段的培养

 

这项研究显示，源于活组织切片样本的新培养技术能够使干细胞的数量增加，从而获得足够用于有效治疗的细胞。细胞样本从健康眼睛的limb（负责角膜透明的眼睛结构）获得。

 

这种培养方法的重点在于它使获得的细胞保持其特征。这种方法将塑料芯片与一种羊膜芯片结合起来。这种技术的新颖之处集中在使用塑料芯片的第一阶段。从健康眼睛获得的组织片段分割成更小的片段以便于在芯片上培养。

 

组织片段的数量越多就能获得更多数量的干细胞“晕圈”。然后，将获得的细胞样本送到解剖病理学实验室进行细胞的可用性和治疗鉴定。

 

证实后，将这些细胞转移到羊膜上继续培养，这种膜很适合培养用于眼睛再生治疗的干细胞移植。

 

一旦放在羊膜上，这些干细胞以一种均一的方式扩散，从而确保更好的细胞等同性，以便于选择最适合用于治疗的单元。这种方法能够精确地找到用于眼睛细胞移植的细胞群，保证了被移植细胞的质量和数量。（生物通雪花）

 

附：胚胎干细胞培养标准化操作规程

 

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

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培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液          
DMEM(高糖)          
马血清（HS）          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巯基乙醇（55Mm）          
PEST          
ESGRO    

复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。

冻存细胞
冻存液
90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被
准备500ml 0.1％明胶溶液
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。

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