SNP及突变研究的最新工具：HRM高分辨率熔解[创新技巧]

SNP及突变研究的最新工具：HRM高分辨率熔解

HRM技术原理：

HRM（High Resolution Melt），中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。

 

 

HRM高分辨率熔解曲线示意图。
不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状

HRM与常规熔解曲线的区别：

HRM虽然是SNP及突变研究领域中最新的研究手段，但HRM的概念其实早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中1，2，3。当时人们已经提出，并通过实验证明，熔解曲线的变化可以反映核酸性质的差异。限于当时有限的实验手段，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。但人们并未因此而放弃熔解曲线这一分析手段，随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用Sybr Green I荧光染料在在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，Sybr Green I熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用Sybr Green I熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。像Sybr Green I这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，Sybr Green I分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，目前商业化的饱和染料有LC Green，LC Green Plus，SYTO 9和Eva Green。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。

非饱和染料

（饱和染料）

SNP相关研究方法比较：

目前突变/SNP的研究手段大致有三大类，一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，简单的说就是以定量PCR为基础的，比如我们很熟悉的Taqman探针法，以及经常提到的分子信标（Molecular beacon）和FRET（HybProbe），应用这一类方法时需要我们对突变位点或是多态性位点的背景很清楚，针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列/位点特异性探针。第二类是以分子杂交技术为基础的检测方法，如寡核苷酸连接分析（OLA）和动态等位基因特异性杂交（DASH），这几种方法也均涉及到序列特异性探针。第三类是基于PCR技术与其它方法相结合的检测方法，如变性-高效液相色谱（DHPLC）、SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳），这几种方法在PCR扩增的基础上对产物过柱分析，或电泳分析，无需合成序列特异性探针；第三类方法中还包括测序、Pyrosequencing和Ecotilling等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP分析。第一类方法中最常用的技术为Taqman探针法，用于对特定位点SNP的检测，其显著特点是速度快，通量大。第二类方法由于方法的可操作性及其它一些原因，一直没有得到普遍的应用。第三类方法的显著特点是不受位点的局限，可对已知和未知突变/SNP进行操作，但DHPLC仪器昂贵，使用成本高，SSCP和DGGE通量相对较小、操作繁琐、成本高、速度慢；测序是所有突变/SNP检测的金标准，但测序的成本相当可观；Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，特别适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高；Ecotilling是一种在目标区段内筛查SNP的高通量、低成本的方法，但由于需要合成特定的红外引物，所以在样本量少、研究区段多的情况下就无法体现其优势。芯片技术可对样本在全基因组范围内进行SNP扫描，但由于使用成本昂贵，不适用于对大量样本的分析。从以上几类方法的特点可以看出，相对使用成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，可如果既要对已知位点分析又要查找未知位点，那么相对的方法较少，且成本高或操作繁复。而HRM之所以这么多年来一直为人们孜孜以求，也是基于这一原因，它是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法。

HRM对硬件的要求：

高分辨率熔解曲线（HRM）源于熔解曲线，原理完全一致，在实验设计上也很相似，所不同的是熔解曲线的升温速率和所用的染料。由于HRM的目的是能够对于单碱基差异进行区分，所以对温度分辨率的要求相当高。虽然二者都是一个逐步升温的过程，但每一步升高多少温度就决定了它是否可以称为高分辨率。常规熔解曲线升温时每步升高1℃，而高分辨率熔解曲线每步升温0.02-0.1℃，如此才能满足对单碱基差异的区分。另外，作为一种高通量的研究方法，同时需要比较多个样品，因此样品之间控温的均一性同样会影响结果的判定。两孔之间如果温度相差0.1℃就很可能导致最终的熔解温度相差0.1℃，那就无法保证HRM分析结果的准确性，造成偏差，因此HRM对仪器温度的均一性要求同样比较高。大多数常规的定量PCR仪，一般的孔间温差都在0.3-0.5℃，这是常规定量PCR仪无法胜任HRM的主要原因之一，因此，除了温度分辨率之外，温度的均一性也是硬件方面一个很重要的指示。另外，除了对每步升温幅度的控制及温度均一性的要求之外，对光源也有一定的要求，HRM对光源强度的要求更高，以提高检测的灵敏度与分辨率。

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HRM技术优势：

基于它与常规熔解曲线分析的方法类似，其操作方法也相当简便。在用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作。由于HRM完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。HRM在这些方面的优势使其具有极强的可操作性，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。

HRM的应用领域：

1．基因的突变扫描。检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失。
相关研究方向：
1） 样本中特定突变位点（SNP）的筛查。
2） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现。
3） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
4） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。
5） 动植物品质相关多态性位点的研究等。

应用举例：
1） 临床癌症病人特定SNP的高通量筛查。非小细胞肺癌的KRAS基因突变病人对以EGFR为靶点的治疗无效，因  此对此类SNP的筛查对临床治疗方法的选择意义重大4。
2） 单碱基错译突变的筛查。RET原癌基因部分外显子的单碱基错译与常染色体显性多内分泌瘤病2型综合症相关，大部分的此类突变为杂合型突变，常规方法为测序。HRM是一种取而代之的高灵敏度的检测方法5。
3） 新突变的寻找。肺动脉高压PPH病人中BMPR2基因的突变，寻找BMPR2基因的新突变，报告BMPR2杂合型PPH病人的临床特征6。
4） 植物遗传育种。用EMS处理大麦后检测目标基因Rym4中的突变情况；区分GA20ox1A基因野生型的植物及在该基因上发生突变的植株7。
5） 大片段序列变化的检测。研究FLT3基因近细胞膜区的内在前后重复序列中的大片段差异。该区段的突变与20%的急性髓系白血病相关，但是突变的具体位点和长度因病人而异，HRM为此类检测提供了很好的平台8。

2．HLA基因组配型
器官移植的HLA配型、同胞之间HLA基因型确定。
应用举例：快速确定HLA高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA基因型确认9。

3．等位基因频率分析
研究方向：
1） SNP频率分析。

4．物种鉴定、品种鉴定
研究方向：
1） 微生物品种、物种快速鉴定。
2） 动植物品种鉴定。
应用举例：临床细菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrRNA的实时扩增，并进行HRM分析，每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹，从而可以根据HRM的不同对细菌进行鉴定10。

5．甲基化研究
研究方向：
1） 甲基化位点的筛查。
2） 甲基化程度分析。
应用举例： 用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1%的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。HRM是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助11。

6．法医学鉴定、亲子鉴定。检测单核苷酸多态性SNP鉴定，插入/缺失多态性DIP鉴定等
应用举例：将HRM用于法医学SNP、DIP鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法，HRM是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法12。

HRM实验示例：
下面是上海市瑞金医院某重点实验室用Rotor-Gene 6000（5plex+HRM）检测临床样本SNP的HRM实验结果：

HRM标准视图及差异视图：

 
 
 
 
基因型分析结果：

No.	Colour	Name	Genotype	Confidence %
2		p1-3	hetero	99.85
3		p1-3	hetero	99.58
4		p1-6	mutant	91.45
5		p1-6	mutant	95.86
6		p1-9	mutant	99.81
7		p1-9	mutant	99.66
10		p2-3	mutant	99.57
11		p2-3	mutant	99.57
12		p2-6	hetero	98.66
13		p2-6	hetero	98.66
14		p2-9	wild	98.48
15		p2-9	wild	98.48
16		p2-12	hetero	96.74
17		p2-12	hetero	95.21

用HRM分析所得的结果与样本实际基因型完全吻合，同时结果具体很好的重复性。
总结：

近几年来国外大量研究工作已表明，HRM高分辨率熔解是一种大通量、快速、灵敏度高、低成本、不受检测位点局限的闭管检测的突变与基因型分析方法。其相关工作已获国际高等级杂志，如Nature Genetics13、Nature Protocols14等认可。在未来的突变筛查、基因型分析，特别是SNP相关研究中HRM技术一定会得到广泛的应用。

参考文献：
1． Crothers, D.M. Biopolymers 1968;6:391-1404
2． Wartell, R.M. and Montroll, E.W. Advances in Chem. Phys. 1972;22:129-203 (John Wiley & Sons)
3． Guttmann, T., Vitek, A. and Pivec, L. Nucleic. Acids Res. 1977;4:285-297
4． Krypuy, M. et al., BMC Cancer 2006;6:295
5． R. Mao, et al., Clinical Chemistry 2006;52:138-141
6． LDS Hospital and Westminster College, Salt Lake City Utah. 2004
7． Defra Wheat Genetic Improvement Network – The Core Research Project，Special WGIN Resource Newsletter，March 2007
8． C. P. Vaughn and K. S. J. Elenitoba-Johnson, Journal of Molecular Diagnostics 2004;6:211-216
9． L. Zhou, et al., Tissue Antigens 2004;4 (2) :156–164
10． J. C. Cheng, et al., Clinical Chemistry. 2006;52:1997-2004
11． T. K. Wojdacz and A. Dobrovic, Nucleic Acids Research, 2007;35(6): e41
12． J. Ye and E. J. Parra, et al., J Forensic Sci. 2002;47(3):593–600
13． A. Sandilands, et al., Nature Genetics. 2007; 39(5):650-654
14． J. Montgomery, et al., Nature Protocols. 2007; 2(1):59-66