用GST MultiTrap FF 96 孔滤板筛选纯化GST 标记蛋白的最佳缓冲液[创新技巧]

GST MultiTrapTM FF 是一种预先包被好的96 孔滤板，用于可重复、高通量筛选与快速纯化谷胱甘肽-S 转移酶(GST) 标记蛋白质。本文描述了用新型GST MultiTrap FF96孔滤板筛选从未澄清的大肠杆菌BL21裂解液中纯化GST-hippocalci (海马钙蛋白) 所需最佳结合缓冲液的实验方法。

方法
用MODDE 软件 (Umetrics) 设计筛选缓冲液研究方案，以确定从未澄清的大肠杆菌BL21 裂解液中纯化GSThippocalci所需的最佳结合缓冲液。多种随机试验的缓冲物质变化范围:10-20 mM 磷酸钠;50-100 mM Tris-HCl; pH 6.2-8.0; 140-400 mM NaCl; 0-5 mM DTT; 0-5%甘油和0-2 mM谷胱甘肽。同时，对超声和市场上细胞裂解试剂盒CelLyticTM Express (Sigma-Aldrich) 裂解大肠杆菌的效果也进行了比较。表1详细总结了所用缓冲液及裂解方法。32 种不同的结合缓冲液随机加到滤板上，每种结合缓冲液做三个平行样。先将G S T -hippocalcin 结合到滤板孔内，然后洗涤两次，最后用50 mM Tris-HCl，pH 8，10 mM还原型谷胱甘肽洗脱进
行蛋白纯化。

结果
样品和结合缓冲液中还原型谷胱甘肽能显著降低纯化GST-hippocalcin 的产量 (表1，图1 泳道5，7，10）。pH值降低 (pH 6.2) 时，可见纯化GST-hippocalcin 的产量提高。实验发现，不同缓冲液和添加剂 (如DTT，甘油，氯化钠) 对纯化结果影响不显著。

10-20 mM磷酸钠，140-400 mM氯化钠，pH 6.2-7.4 的结合缓冲液纯化效果最佳，得到GST-hippocalcin 的产
量与纯度最高 (表1)。此外，超声或细胞裂解试剂盒都可用于裂解大肠杆菌，两种方法对纯化结果无明显差
异。SDS-PAGE图谱显示，用GST MultiTrap FF纯化GSThi p po c a l c i n 时，不同的缓冲液条件对纯化GS T -hippocalcin的纯度没有显著影响。表1列出的不同缓冲液对GST-hippocalcin的纯化产量的影响得到SDS-PAGE图谱 (图1) 的证实。

结论
研究结果表明，使用一种最佳的结合缓冲液对纯化GST标记蛋白很重要。GST MultiTrap FF 96 孔滤板为确定最佳缓冲液条件提供了一个简便、快速的筛选工具。

96 孔滤板： GST MultiTrap FF
样品： 含有GST- 海马钙蛋白 (分子量45,000) 的未澄清大肠杆菌
BL21 裂解液
纯化程序： 执行GST MultiTrap 说明书，28-4070-75
样品制备： 比较CelLytic Express 试剂盒和超声裂解法。两种方法均按
照标准规程进行操作
样品体积： 500 ml
洗脱体积： 3 ×200 ml
结合缓冲液：多种缓冲物质随机试验：10-20 mM磷酸钠；50-100 mM
Tris-HCl；pH 6.2-8.0；140-400 mM NaCl；0-5 mM DTT；
0-5%甘油，和0-2 mM 谷胱甘肽
洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl，10 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0
洗脱方法： 离心
数据评估： MODDE 软件，紫外分光光度计 (A280)，SDS-PAGE

图1. 用SDS-PAGE (还原条件，浓度8-18% 的ExcelGelTM SDS梯度胶；CoomassieTM染色) 对从GST MultiTrap FF滤板孔中洗脱的GST hippocalcin收集组分进行分析。其它关于产量和纯度的细节见表1。