超微量SNP基因分型:用mosquito进行PCR制备[创新技巧]

【字体: 时间:2008年10月15日 来源:生物通

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  聚合酶链式反应(PCR)是很多技术的基础,如单核苷酸多态性(SNP)。人们总是期望反应体积能尽可能地小,因为某些试剂还要向罗氏公司交纳专利转让使用费,而且引物/探针和DNA样品可能很稀有或者昂贵。mosquito液体操作系统提供了基于一次性加样针头的灵活、准确的移液操作,这篇研究表明mosquito能将SNP基因分型的384孔板PCR反应体积降至2ul以下,带来可观的试剂节约和通量增加 (TTP供稿 生物通翻译)

    聚合酶链式反应(PCR)是很多技术的基础,如单核苷酸多态性(SNP)。人们总是期望反应体积能尽可能地小,因为某些试剂还要向知识产权持有者-霍夫曼•罗氏公司交纳专利转让使用费,而且引物/探针和DNA样品可能很稀有或者昂贵。近年来热循环仪、读板机和微孔板的发展使分析能在384孔PCR板中进行,反应体积只需要5-10ul。

    mosquito液体操作系统提供了基于一次性加样针头的灵活、准确的移液操作,体积可低至50nL。这篇研究表明mosquito能将SNP基因分型的384孔板PCR反应体积降至2ul以下,带来可观的试剂节约和通量增加。

简介:SNP基因分型
    SNP是指在一个群体中,某个碱基存在两种形式(等位基因);例如SNP可能是C(胞嘧啶)和T(胸腺嘧啶)等位基因。在人类基因组中每1000个碱基对可能出现1个SNP,人们努力去发现和鉴定这些SNP,以作为发现和诊断疾病基因的工具。

    5’核酸酶分析(也就是大家所熟悉的TaqMan分析)能根据特异探针的杂交及Taq DNA聚合酶特有的5’-3’核酸外切酶活性,使得每个等位基因释放出不同荧光标记,从而得以分辨SNP等位基因。

    通过侧翼引物进行的PCR在同一个分析中使用了两个荧光寡核苷酸探针。专一设计的探针特异性针对包含SNP的区域,探针包括5’端荧光报告基团和3’ 端的淬灭基团,如果杂交发生,5’核酸酶活性就会切割探针,从荧光淬灭基团中释放出荧光报告基团。带有不同荧光报告染料的两种不同探针,加入反应中用于分辨等位基因,每一种染料对应一个需要被分型的等位基因变异。

    如果探针与靶DNA序列间存在错配,杂交会显著减少并终止荧光报告染料的切割,因此荧光信号的释放也减少。每个信号的大小显示出哪一种等位基因存在。在3’端引入两个修饰基团能显著改善探针的灵敏度----非荧光的淬灭基团能降低背景信号,MGB修饰基团(minor groove binder,一种3肽)能增加反应的灵敏度。

材料与方法
    MRC geneservice(一家英国的科研服务的主要供应商)用5ul总体积进行SNP基因分型,这是该类分析的公认小体积。利用mosquito,将标准的反应体积5ul和更小的反应体积1.7ul的分析性能进行了比较。mosquito具有纳升移液能力,能进行更小体积的分析,之所以选择1.7ul是确保分析产生的荧光信号能被ABI 7900检测到。

5ul分析
    一组DNA样品排列在96孔微孔板中,每孔约20uL。反应混合液(包括探针和引物)在384孔板的一列中制备。DNA样品组分别取1.5uL转移到384孔板中,与3.5uL 反应混合液混合。分析是在ABI 384孔板的偶数行中进行的,由于列的密度间隔从9mm压缩到4.5mm,因此只用了第1-12列。尽管在这项研究中只测试了一组96个DNA样本,但这个设置可以将4个96孔板的样品加到同一个384孔PCR板上。

    由于mosquito主要用于纳升级移液操作,移液加样针最大体积为1.2uL,反应混合液的体积通过3次移液(1.2、1.2、1.1uL)来实现,使用一套8个移液加样针头完成所有孔。

    同样地,1.5uL DNA分成两个750nL加入,但这回每次加样使用新的移液加样针头来防止DNA样品的污染。对于使用mosquito来说这是一个简单步骤,因为该仪器的核心是一卷36000个一次性的微量移液加样针头。为了避免交叉污染,用过的移液加样针被丢弃掉,新的移液加样针进入微孔版中取样,省去了耗时的洗涤循环的步骤。

1.7uL分析
    采用与前面实验同样一组DNA样品,同样的方法分析,不过反应体积减少了。一次移取515nL DNA样本(每次使用干净的移液加样针)加入到1.2uL反应混合液(用一套8个移液加样针先加入到干净的孔中)。这些体积的比例与上面5uL分析相同,通过单次转移就能实现。这些分析在上面平板的相同行,第13-24列中进行。

热循环和分析
    准备好的384孔板用Abgene透明封口膜(强)热封,在ABI 7900HT中反应和读数。结果根据两个等位基因特异的荧光基团(VIC和Fam)的强度绘制成图。

    图中显示了数据点的三个主要簇。右下是VIC荧光染料强度与Fam荧光染料比较相对较强的数据点,对应于DNA样品中单个SNP纯合等位基因。左上较小的数据点簇则与第二个SNP纯合等位基因相对应。在这两组数据点组之间,有第三个簇,对应两种SNP杂合的样品。

    4个数据点位于原点附近。它们对应两个水样品(无模板对照NTC)和两个异常值。异常值在每个实验中对应相同DNA样品。这些样品扩增失败,可能是由于DNA质量不好。

    通过数据点离散的紧密程度和分散程度可以表明这些数据的质量。在这项研究中,1.7uL总体积分析具有更好的数据质量,而信号水平与5uL分析相似。

结论
    这项研究表明利用mosquito将PCR SNP分析的制备和分析降到1.7uL的反应体积是可行的。数据质量与5uL反应体积相当甚至更高。因此可以通过降低分析使用的试剂量来降低费用。这个发现为mosquito液体处理器能在SNP分析中降低超过一半以上的试剂费用提供了证据。(TTP供稿 生物通翻译)

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