microRNA芯片实验选择[选购宝典]

    microRNA（miRNA）作为21世纪生命科学研究最为重大的发现，已经在短时间内成为了世界顶尖科学家研究的焦点，并迅速取得了令人瞩目的进展，短短几年关于miRNA 的研究报道已近2000篇，并被《Cell》《Nature》等杂志大量收录。这些发现为我们勾勒了一个全新的、原本不为人知的基因转录后调控系统，极大的扩展了人类对于基因调控方式的认识。miRNA通过RNA干扰这种独特的方式影响着生命活动中的诸多方面，包括肿瘤的发生、发展、耐药；胚胎的分化、发育；细胞的凋亡；细胞抗病毒感染等方面，以这些突破性进展为基础，而且miRNA也已经成为科学研究的重要工具和多种疾病治疗的新手段。正是基于以上这些重大的意义，在miRNA参与的RNAi现象被发现仅仅几年后，其发现者安德鲁费里和克拉格米洛便获得了2006诺贝尔生理学医学奖，这在科学界是十分罕见的。

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    目前miRNA研究的领域包括：以发现新miRNA为目的的克隆鉴定工作；miRNA生成、作用过程中的相关分子机制研究；利用生物芯片平台研究miRNA表达谱并以此为契机探索miRNA的靶基因和功能（miRNA参与肿瘤转移和耐药，miRNA对病毒感染的影响）等。

    由于miRNA本身分子片段小，种类多，丰度低，要总览miRNAs的全局表达和相互关系、不同条件下表达差异、特别是与疾病的关系，以及miRNA靶基因和功能研究等等，芯片技术无疑是很好的选择。这一技术的原理是收集待测样品中的miRNA，与特定芯片上互补的探针杂交，通常待测样品中的miRNA 3'端会标记上荧光基团，杂交洗涤后可扫描荧光强度，大量数据处理后便可筛选出有显著表达差异的miRNA。由于芯片技术采用大规模微阵列技术，一张芯片上可以同时分析成百上千的探针，大大提高了筛选的速度和通量，因此是miRNA高通量研究的首选。而且由于miRNA芯片的高通量特点，比较于Northern杂交，RT-PCR，液相杂交等方法，miRNA芯片技术是一种更理想的快速有效的检测miRNA表达图谱的方法。

    miRNA芯片技术首次被Liu等人报道用来检测miRNA在不同肿瘤细胞中的表达图谱——245个哺乳动物的miRNA被检测，结果的重复性很好，而且被Northern杂交、RT-PCR 所证实。也有人利用这种技术比较了哺乳动物中B细胞淋巴瘤和正常细胞中miRNA的表达图谱，为miRNA在肿瘤临床应用提出了新的思路；还有科学家通过miRNA芯片检测了小鼠脑发育中138个miRNA基因的表达图谱。这些都说明了miRNA芯片技术的巨大潜力。

    近期，在对HIV病毒研究方面，美国托马斯杰弗逊大学的研究人员就利用miRNA芯片发现了细胞mciroRNAs抑制了休眠原代CD4+T细胞中HIV-1的产生，从而说明细胞中miRNAs对于HIV-1潜伏性至关重要，也由此miRNAs方面的研究被认为可能可以成为一种根除HIV-1的新方法，这篇文章发表在《Nature Medicine》上。

    不过需要指出的是，miRNA芯片方法并不适用于新miRNA的发现鉴定，此类研究可能需要用到一些新技术，比如miRNA研究奠基人新开发的True单分子测序技术（TrueSingleMoleculeSequencing），以及约翰霍普金斯大学等发现了新型分析技术：miRAGE等。

    目前miRNA芯片不仅可以检测已知的成熟miRNA，还可以通过定制检测预测的miRNA、非编码RNA等，一些相关的配套服务也发展得很快，比如国内的康成和联川就是其中做的比较早的芯片服务公司。一些新上手的实验人员可能对一些基本的情况并不太了解，生物通特别在以下列出了一些相应的信息，希望能帮到有需要的研究人员。

如何选择芯片

    目前市场上提供的miRNA芯片种类不少，如何选择成为了研究人员着手进行实验的第一道“门槛”，一般选择好芯片也就意味着确定了提取，标记等实验过程，接下来就可以按照Protocol一步步完成实验。那么各家芯片产品有什么特点呢？如何评价芯片质量和结果？如何结合自己课题的特点选择芯片呢？

区分能手

丹麦的Exiqon公司是一家在microRNA表达和功能分析领域具有领先地位的欧洲公司，他们的拳头产品就是LNA™专利技术，这个LNA可不是什么低噪声放大器Low Noise Amplifier，而是Locked Nucleic Acid，即锁核酸，这种特殊的双环状核苷酸衍生物结构中含有一个或多个2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2’-O位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性（见下图）。

    由于LNA与RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：和RNA互补的双链有很强的热稳定性、实现探针高灵敏度；水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用；高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。LNA探针与核酸杂交具有严格序列特异性，能有效区分碱基错配从而实现高特异性。因此可以说是一种理想的miRNA捕获探针。

    在此基础上建立的miRCURY™ LNA芯片在操作简便性，灵敏度等方面都具有优势，尤其是特异性方面，miRCURY™ LNA芯片可以区分同源miRNA，也就是说miRNA家族中即使是只差一个碱基的miRNA，miRCURY™ LNA芯片都能够把它们区分出来，这意味着用这个技术可以分辩出所检测的是具有生物活性的成熟miRNAs而非其前体，而且序列高度同源的miRNAs也被非常精确地区分开来。

    Exiqon的miRCURT芯片的LNA探针与普通DNA捕获探针相比，可提升熔解温度，自由设计Tm值，使得芯片上的所有探针Tm值均一化，所有miRNA杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性。杂交温度高（60度）避免非特异结合，标记无序列偏向性，效率高，无需富集miRNA，因而在灵敏度方面，LNA芯片可以检测常规DNA探针无法检测到的极其微量的microRNA。其454个捕获探针包括与人（328个），小鼠（274个）和大鼠（238个）microRNA精确配对的探针，对照探针以及错配探针，可以检测Sanger miRBase数据库8.0版中所有已知的人、小鼠、大鼠microRNA，另外还有Exiqon芯片特有的144条miRPlus探针，而且每张芯片对同一样品重复4次，进一步提高了芯片的可靠性。这些都是miRNA芯片研究中需要注意的问题。

    目前国内康成生物独家代理Exiqon的miRNA芯片已有三年了，不仅提供相关产品，而且技术人员还可以帮助完成实验操作，只要提供给他们完好的组织或细胞样本，就可以拿到完整的实验报告。

全能官家

    LC Sciences公司（联川）的miRNA芯片有两大卖点，一是探针信息随SangermiRBase数据库实时更新，刚刚在9月全球首推最新Sanger 12.0版microRNA探针信息，其标准microRNA微阵列芯片可对最新版数据库报道的包括人、大鼠、小鼠、斑马鱼、鸡、猪、水稻、玉米、拟南芥、病毒等在内的所有单个物种或是同类物种组，如哺乳动物、植物等的microRNA进行检测，并提供完整的数据分析。Sanger microRNA数据库(miRBase) 12.0版于2008年9月1日发布，最新版本报道了8273条成熟microRNA序列，新增2062条，是史上规模最大的一次版本更新。详细资料可参考生物通有关网页。另外客户可在标准微阵列上免费添加100条定制序列（不超过25nt）。也可以自行定制任意3918个探针序列的芯片。

    另外一个卖点是采用µParaflo™ 微流体芯片技术----即在指头大小的微流体芯片上的纳升级微室中合成探针序列。所谓微流体（微流控），Microfluidics，是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一个过程。由于有流体行为（属于物理学范畴）的加入从而使得这种芯片更节省试剂，缩短了时间，因此被称为微阵列芯片的延伸，也有人将微阵列称为第一代生物芯片，而将微流体芯片称为第二代芯片。在生物实验中，常常需要对流体进行操作，比如样品的制备，标记等都是在液相环境中进行的，如果可以将这些过程都集成在芯片上，那么实验所用的流体的量就可以从毫升，微升级降至纳升或皮升级了。µParaflo™ 微流体芯片技术由数以千计的三维小室组成，样品容易分布均一，是一个封闭的系统，因此不用担心空气的污染和荧光染料的氧化和衰退，自动化程度更高，更适合于高通量的应用。

    µParaflo™ 专利的检测探针包含一段化学修饰过的编码区和一个延伸臂片段，专利的修饰技术不含常规化学修饰的“粘性”特征，可同时提高检测灵敏度和特异性，延伸臂可保持编码片段和片基的距离以减少杂交空间阻碍，调整每个探针的修饰数目可对Tm值均一化从而提供良好的杂交特性。微流体芯片技术和专利的探针修饰技术保证芯片检测的特异性，单碱基错配(1MM)能够使杂交检测信号至少会降低30倍，甚至100倍。检测极限经实验证实可小于100attomole，检测动态范围不小于3.5logs。

    LC芯片是采用原位合成技术（Photogenerated acid结合传统DMT化学）而非点样，便于精确控制探针浓度（一致性好），有很高的灵活性，比如可以随意增加预测miRNA，或者对序列探针采用Walks步移的方式来筛选发现新的miRNA，有助于通过不同物种miRNA序列来确定物种间的保守miRNA！这种芯片可以对序列探针低系统噪音保证显著性表达差异数值的真实性。同一样品双色标记实验呈现出极佳的相关性。LC芯片上每个探针至少有3个重复（标准人类miRNA芯片5个重复）。微阵列合成有严格的质控，每个微阵列实验都含有16组均匀分布的控制探针用于整个实验过程的质控，与两个分别标记Cy3和Cy5的测试DNA Oligos（包括匹配和单碱基错配）杂交，通过检测信号来评估杂交一致性和特异性，确保同型芯片点与点协方差小于15%，以及完全匹配/单碱基错配的探针信号比值大于30。

    LC Sciences µParaflo是LC Sciences公司与Atactic Technologies公司联合开发出的一种新型芯片技术，是一种全能性芯片，必须通过他家的服务完成标记，清洗，杂交等过程，无需自己摸索实验条件----你不能亲自操作，也不能单独购买芯片----嗯？感觉不太好？不过你可以有更高层次上的主动---可以参与设计，既可以在标准芯片上自行设计100个以内的探针，也可以3918个探针全部自己设计定制！LC芯片适合利用这种技术进行设计分析，而不愿意花费太多时间在操作芯片实验上的“思考型”研究人员。

    因此，除了精心设计好可以免费添加的100个探针，你只需要提供0.5ug-10ug的总RNA（10ug最好啦），或者纯化的小RNA样品（<300bp）0.5ug-2ug，不需标记或者扩增（联川采用放大信号而不是扩增的方法检测少量的miRNAd ），交给国内的联川生物就可以了等结果了。当然，样品RNA的纯化是有点讲究的，这个生物通在后文中会提到。

如何进行miRNA芯片实验

    miRNA芯片实验主要步骤是选择芯片（或者定制，自制），样品RNA提取，标记和杂交，结果扫描和分析。

1.选择芯片

    由于miRNA的特殊性，商品化芯片或者知名厂家定制芯片是首选。特别是当前miRNA芯片产品设计已经相当灵活和可以实时更新的情况下。因为自制产品毕竟不如商业化产品标准化，在这个“同行评议”高于一切的学术圈，恐怕难以得到多数顶级刊物的认同。而一篇文章发表在什么地方，对文章的身价影响有多大，乃至对作者的职称经费和各色评选的影响，就不用多说了吧。另外一个方面，假阳性也就罢了，后继的试验还可以剔除，最多就是浪费了感情和精力和试剂，如果因为自制产品不过关而漏掉了某些重大成果，岂不是要嚎啕？因此，有条件的还是尽量选择比较成熟的现成商品和配套服务为好。生物通前面介绍的3种产品均已经有文献在各类顶级刊物发表（就是说产品可靠程度已经得到顶级刊物评委认同啦）。

定制芯片

    众多的学者，各有不同的研究方向。标准商品化芯片有不少可以增加一些可以让用户自行设计的样品点。但是如果这些还是不能满足要求时，那么灵活多选的定制芯片也许能满足你的要求。

    定制芯片的选择更多取决于探针设计。由于miRNA本身长度的原因，成熟miRNA长度不超过22个核苷酸，因此不可能随着熔解温度（Tm）调整探针序列，这确实是miRNA芯片分析的一个大麻烦，专业的商业平台有不同的方法以辅助解决这个问题，比如Aglient的探针在miRNA互补区域就有一个stem-loop序列，当miRNA进行杂交时，就能利用stem的双区域增加了配对能量，完成要求更加严格的实验。而Exiqon的探针则相反，利用的是LNA（locked nucleic acid），这样可以使熔解温度升高，而且LNA与核酸杂交有严格的序列特异性，比普通寡核苷酸更有效地区分碱基错配。LC的探针则有专利的修饰可以同时提升灵敏度和专一性，通过修饰个数的不同调整均衡Tm值。

    LC Sciences的最新Sanger miRBase V12.0版microRNA微阵列芯片检测服务，新增2062条miRNA序列信息，包括新增15个物种：10种果蝇（764条），鸭嘴兽（331条），番茄30条，赤拟谷盗45条，和2种病毒。黑猩猩新增495条，人类新增17条miRNAs，小鼠新增16条，拟南芥新增3条，水稻新增84条，红原鸡326条，目前联川生物提供了利用新增的miRBase探针信息设计和定制探针的服务。   

    除了生物通前面提到过的，还有先进通量公司的CombiMatrix MicroRNA芯片，这种芯片是建立在CustomArray™ 4X2K定制芯片的版本基础上的商品芯片，芯片产品包括物种类型有：人、大鼠、小鼠、线虫、果蝇、拟南芥、玉米等，这些芯片探针均来源于Sanger Database (version 9.0)。芯片实验人员可以从Sanger 9.0 database中选择任何物种信息作为MicroRNA的内容来定制CombiMatrix MicroRNA芯片。

    那么如果我的样品很珍惜又特殊呢？比如压根儿就不在Sanger数据库里的大熊猫或者华南虎、藏羚羊之类的miRNA芯片研究呢？哪来的商品化产品呀？那么问问联川生物或者康成生物吧！他们都可以提供或者代理原位合成芯片，大概可以按照你的设计帮你合成吧，只要你能付得起。也比自己合成miRNA自己点片要好。   

    Aglient公司的SurePrint专利技术实现在1” x 3”的玻璃片基上灵活，大规模的原位合成寡核苷酸探针，这一技术能很灵活的响应并实现芯片探针设计方案，芯片密度可以是244K，2x105K，4x44K，8x15K等，目前国内康成生物就又代理这些定制。

 

2.RNA提取

总RNA的提取方法有很多，比如可以利用Trizol进行RNA的分离，具体见生物通技术文章如何提取小小的miRNA？和RNA纯化技术，但无论用的是何种方法或何种试剂盒，需要注意的是要保护好小分子RNA，避免用离心过柱式的RNA纯化试剂——因为常规的抽提试剂盒都是为了分离mRNA而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以提高mRNA得率，这样正好获得了相反效果---也就是说，可以选择传统的方法：Trizol抽提。由于小RNA沉淀慢，需要-80度过夜沉淀。如果实在讨厌胍和酚氯仿抽提的麻烦和漫长的沉淀离心过程，也可以选择专门提取小分子RNA的试剂盒，比如Ambion的mirVANA，虽然也是方便的离心过柱式，不过纯化柱可是特别改良专门保留了小分子RNA的。

3.标记和清洗

    miRNA表达谱分析是一种对所有已知miRNAs的表达模式进行研究的强有力的方法，这种方法也许将来能在疾病诊断和治疗中大放异彩，但是进行这一实验的一个首要前提就是必须能可重复性的检测到所有的miRNA，而不同的microRNA标记方法会直接到芯片表达谱这一精确性，因此要精心选择合适的miRNA标记系统。

    由于miRNAs小分子的限制，其标记也就需要特殊的方法，较为常用的标记方法是酶法和化学法。前者主要基于poly(A)聚合酶I，在纯化后的miRNAs的3’端上加上多个氨基染料修饰的核苷酸，简单而灵敏，比如Invitrogen的NCode™ miRNA Labeling System。

 

 

   

另外一种方法就是化学标记方法，比如 Label IT——将荧光标记直接通过共价作用加在miRNA分子上。PerkinElmer的MicroMAX ASAP miRNA标记也属于这一方法，主要用于在miRNA上标记生物素和荧光素，步骤简单，仅需一个步骤，无酶的体外化学法标记。


    两种方法的比较：化学标记方法简单，灵敏度比较高，而正因为灵敏度高可能造成标记不稳定，而酶标记方法比较麻烦，但结果比较稳定和可重复性好。

4.杂交

    幸好有多色荧光标记的存在，使得芯片杂交通常可以进行双重样品双色标记。要分析表达差异，最好将2个样品分别用不同颜色的荧光标记，同时将2个样品杂交稻同一张微阵列芯片上，不同的样品标记颜色不同，检测时会有不同的颜色，便于比较表达差异。由于在同一张片上，可避免芯片之间的差异对结果的干扰。不过，为减少两种荧光标记间的差异对结果造成干扰，通常还可以进行荧光标记互换，再共同杂交一次，从而提高结果可靠性。

    杂交反应的过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。除了传统的杂交盒，这个过程还可以在Bio-Rad伯乐的Frame-Seal Slide Chambers上完成，这个Chamber背面具粘附性，能粘在玻片上样品区域，加入反应物后，用弹性的塑料膜密封。这种密封气密性，能经受住97℃的高温，并且循环结束后，整个反应室很容易从玻片上拆卸下来。

    这样就基本完成的miRNA芯片分析的实验部分，后续的数据分析可以根据选择的芯片所提供的数据库进行分析，所以开始选择芯片的一步尤为重要。总的说来还是那句话，适合的才是最好的，miRNA芯片技术对于越来越多运用到的小分子RNA研究而言意义重大，希望着手进行这方面实验的实验人员能从上文中获得一些收益。