蛋白相互作用新方法：TAP

　　

生物通报道：蛋白从来不会“单独行动”，因此在分子水平上利用这种相互作用关系能识别出新蛋白的功能，这对于蛋白质研究来说是令人欣喜的，不过这常常需要首先阻止蛋白与其它蛋白的相互作用。有两种技术是可以避开这个限制，在蛋白质组水平上获得蛋白相互作用的图谱，这就是酵母双杂交系统（yeast two-hybrid assays）和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation） 技术。

由于酵母双杂（Y2H）技术既是在真核系统中，又能在活细胞中研究蛋白相互作用，并且功效上能对蛋白之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，因此被认为是一种具有高灵敏度的研究蛋白之间关系的，而且适用于蛋白质组学范围的分析技术平台。近年来许多文献表明酵母双杂交技术被广泛的应用到了蛋白研究中：可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白之间的互作。

不过需要指出的是，如果研究的目的蛋白以复合物的方式同时与多种partner分子相互作用，那么酵母双杂就不太适用了。而且酵母双杂要求融合蛋白是在细胞核里表达和定位的，并且也不能是膜蛋白，转录激活因子，和哺乳动物翻译后修饰的蛋白。

来自澳大利亚科学研究院分子医学中心（Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences）的研究人员发展了Y2H方法，避开了以上这些难题。

分子医学中心主任Giulio Superti-Furga在其“酵母和哺乳动物细胞中蛋白复合物图谱构建”的研究（Nature, 440:631-6. 2006；Nature Methods, 3:1013-9, 2006）中遇到了一些难题：由于Y2H只能检测两者相互作用的关系，不能分析多蛋白复合物，而coIP /MS方法又需要高质量，特异性抗体，研究小组很难完成这些要求，因为他们是从细胞中分离的天然复合物。

为了解决这一问题，Superti-Furga研究组调整了他们的实验方案，加入了一步称为串联亲和纯化（tandem affinty purification，TAP）的方法，这种方法是coIP /MS方法的“近亲”，但是不需要蛋白质组范围内的不同抗体。

不同于传统的coIP，TAP方法可以通过两步特异性亲和纯化，快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白。即首先通过免疫球蛋白偶联磁珠（immunoglobulin-coated beads）进行纯化，然后通过蛋白酶消化（钙调蛋白偶联磁珠（calmodulin-coated beads）），最后通过MS洗涤和纯化复合物。

TAP方法的适用对象与coIP /MS方法相似，不同于Y2H（以及LUMIER）——因为TAP不能用于分析双蛋白相互作用关系，但能揭示一些其它方法可能忽视的方面。

这种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术最初用于酵母中，因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展，至今已成功运用于许多其他生物。

Superti-Furga表示，“当标记好的蛋白离开核糖体，就会和天然partners相互结合，从而帮助TAP方法捕捉添加上的顺序，即一个蛋白是一个一个结合上去的，或者是翻译后修饰”，这种方法“能告诉你两件事情：特殊过程中参与的成员，以及这些成员‘出席表’”。

但是他也警告说，“需要当心的是，也许不能确保结果是否是由于污染物造成的情况，因为一些蛋白的浓度非常高。”

（生物通：张迪）