快速PCR之空手套白狼[心得点评]

近年来涌现出不少仪器和试剂，让PCR的速度越来越快。尽管这些工具让我们省了不少心，但拥有快速PCR仪的实验室并不多，快速PCR酶也没有普及，我们只拥有普通的PCR仪和酶，但又想PCR做得更快一点，那也并非异想天开。在本文中，就让Bio-Rad的专家来告诉你如何空手套白狼，以最少的投入让PCR加快3-4倍。

最初的变性
PCR反应的最初步骤是在94-96℃孵育2-20分钟。这个步骤将最初的模板变成单链，并激活热启动的聚合酶。但是即使是对全基因组DNA而言，只要94-95℃ 2-3分钟也可以完全变性。有些热启动的聚合酶需要15-20分钟才能达到最大活性，但如果选择抗体修饰的热启动酶，比如iTaq，只需98℃ 15-30秒就能完全激活。

循环中的变性
PCR循环中的变性时间就没有最初那么严格了，因为变性的模板只是PCR产物，它比初始模板短得多，也简单得多。Bio-Rad的专家用iQ supermix试验过，只要在92℃变性1秒钟就足够了，对产物几乎没有影响，包括GC含量高达83.5%的产物。这与Yap和McGee（1991）的结论一致，他们认为500bp以下的PCR产物就根本无需92℃的变性。

退火和延伸
由于许多DNA聚合酶在很宽的温度范围内（55-72℃）都具有高活性，所以PCR的退火和延伸也可以压缩成一个步骤。少了一个步骤，时间自然也节省了不少。在大部分情况下，标准的退火时间（15-60秒）和延伸时间（1 min/kb）其实是过长了。引物与模板是高度同源的，因此在适当的温度下只需要几秒钟就能完成退火。一些优化好的反应体系也能有效节省延伸时间。例如使用iTaq，15秒的退火/延伸对500bp的产物而言就足够了。

优化退火/延伸的温度对PCR反应来说还是十分重要的，因为它决定了反应的特异性。如果退火温度太高，引物不能有效退火，会导致无产物或产量低；如果太低，引物错配，非特异扩增又会出现，质量大打折扣。为了最大化速度和特异性，应使用不牺牲产量的最高退火温度。这时就需要一台梯度PCR仪来帮忙了。

特别提示：如果你要为快速PCR反应重新设计引物，利用引物设计软件（如Primer3）将会是一个很好的选择。你只需设定想要的引物Tm值就行了。利用现成的引物也可以，只要在5’端多加2-4个碱基。不过，你还要确认一下这样做是否产生了新的错配或自身配对。

最后的延伸
一般来说，PCR最后的延伸步骤都是70℃ 5-10分钟。尽管它被称之为延伸步骤，但是主要还是为了让PCR产物退火形成双链，以便用于克隆或电泳。Bio-Rad的专家把时间缩短到30-60秒，发现它对100-1000bp的PCR产物几乎没什么影响。

循环数
起始模板浓度高的话，PCR的循环数小于20都是OK的。但如果靶DNA的拷贝数低（如100个拷贝），那必须做35个循环才能产生足够的产物，在电泳中检测到。起始模板越少，模板就应该相应增加。实际上，很多时候我们不清楚模板的量有多少，那么为保险起见，最好还是做35-40个循环。

快速PCR专题到此结束。如果大家还有什么独家秘籍，欢迎与我们共享。

 

（生物通 余亮）