优化蛋白相互作用实验(一)[创新技巧]

【字体: 时间:2008年10月29日 来源:生物通

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  利用一些方法和手段能避免蛋白相互作用研究方法的短处,利用其长处,这里提及了一些著名实验室采用的方法,以及一些技术上创新的市场产品,希望能有助于您的实验研究。

蛋白从来不会“单独行动”,因此在分子水平上利用这种相互作用关系能识别出新蛋白的功能,这对于蛋白质研究来说是令人欣喜的,不过这常常需要首先阻止蛋白与其它蛋白的相互作用。有两种技术是可以避开这个限制,在蛋白质组水平上获得蛋白相互作用的图谱,这就是酵母双杂交系统(yeast two-hybrid assays)和免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)技术,这也是比较常用的两种方法。

其实研究蛋白相互作用的方法有很多,除了传统的生化共纯化,目前被广泛接受的还有噬菌体展示,等离子共振技术,荧光能量转移技术等等。不过由于特定蛋白的内在性质在某种程度上决定了哪种技术能有效的用于分析其蛋白相互作用,因此选择之前要下好功夫,比如如果一种相互作用可能是由于翻译后修饰介导的,因为只能在真核系统中发生,那么噬菌体展示技术就用不上了。

由于酵母双杂(Y2H)技术既是在真核系统中,又能在活细胞中研究蛋白相互作用,并且功效上能对蛋白之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,因此被认为是一种具有高灵敏度的研究蛋白之间关系的,而且适用于蛋白质组学范围的分析技术平台。近年来许多文献表明酵母双杂交技术被广泛的应用到了蛋白研究中:可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白之间的互作。

不过需要指出的是,如果研究的目的蛋白以复合体的方式同时与多种partner分子相互作用,那么酵母双杂就不太适用了。而且酵母双杂要求融合蛋白是在细胞核里表达和定位的,并且也不能是膜蛋白,转录激活因子,和哺乳动物翻译后修饰的蛋白。

如果你研究的对象正好在其列,那么也许可以考虑下免疫共沉淀技术coIP:通过coIP从细胞裂解物中钓蛋白,然后利用质谱MS技术进行分析,这样也得到活细胞中可靠的蛋白相互作用,不过这种方法也有缺陷:要求要有目的蛋白的抗体,会忽视弱的,以及低富集的蛋白相互作用,而且只能识别复合体的形式,而不是哪个蛋白与哪个蛋白结合了。

利用一些方法和手段能避免以上蛋白相互作用研究方法的短处,利用其长处,这里提及了一些著名实验室采用的方法,以及一些技术上创新的市场产品,希望能有助于您的实验研究。

 

1.如何进行蛋白复合体相互作用实验?

生物体内每个蛋白并不是独立的在细胞中完成功能,它们通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体,在特定的时间和空间内完成特定的功能,而且有些蛋白的功能只有在复合体形成后才能发挥出来,另一方面,某些蛋白可能参与了不止一个的复合体,简单的两两相互作用研究就不足以阐明这种更为复杂的相互作用,因此目前许多蛋白组研究需要首先搞清楚复合体之间的相互作用。

但是常规的Y2H只能检测两个蛋白相互作用的关系,对于复合体无能为力,而利用coIP/MS方法又常涉及到大量高质量,特异性抗体,那怎么办呢?

来自澳大利亚科学研究院分子医学中心的主任Giulio Superti-Furga发展了Y2H方法,避开了以上这些难题,并利用新方法完成了其“酵母和哺乳动物细胞中蛋白复合体图谱构建”的研究,并发表了两篇文章(Nature, 440:631-6. 2006;Nature Methods, 3:1013-9, 2006)。

这种方法就是串联亲和纯化(tandem affinty purification,TAP)法,TAP方法是coIP/MS方法的“近亲”,但是不需要蛋白质组范围内的各种不同抗体。

不同于传统的coIP,TAP方法可以通过两步特异性亲和纯化,快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白。即首先通过免疫球蛋白偶联磁珠(immunoglobulin-coated beads)进行纯化,然后通过蛋白酶消化(钙调蛋白偶联磁珠(calmodulin-coated beads)),最后通过MS洗涤和纯化复合体。

基本原理如下图:




















 

(TAP亲和层析纯化原理。图片来自“大规模蛋白质相互作用研究方法进展”)
TAP方法的适用对象与coIP /MS方法相似,不同于Y2H(以及LUMIER)——因为TAP不能用于分析双蛋白相互作用关系,但能揭示一些其它方法可能忽视的方面。

Superti-Furga表示,“当标记好的蛋白离开核糖体,就会和天然partners相互结合,从而帮助TAP方法捕捉添加上的顺序,即一个蛋白是一个一个结合上去的,或者是翻译后修饰”,这种方法“能告诉你两件事情:特殊过程中参与的成员,以及这些成员‘出席表’”。

但是他也警告说,“需要当心的是,也许不能确保结果是否是由于污染物造成的情况,因为一些蛋白的浓度非常高。”

这种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展,至今已成功运用于许多其他生物中。现在TAP方法还与RNAi技术联用在一起,形成iTAP方法,这样可以避免内源蛋白的干扰,从高等真核细胞中分离并鉴定相应的蛋白复合体。

目前可以从欧洲基因资料中心(European Centre for Genetic Archives, EUROSCARF)获得TAP质粒和菌株,价格约为15-30欧元。如果想要比较成熟的产品,那就可以选择Stratagene的InterPlay TAP系统。

这是目前市场上唯一的应用于哺乳动物细胞的TAP系统,原理就是将链亲和素结合多肽(SBP)和钙调素结合多肽(CBP)这两个亲和标签与目的蛋白一起表达,利用专一的亲和力(SBP标签-链亲和素树脂:29M-1;CBP标签-钙调素树脂:19M-1)和非常温和的生物素、EGTA洗脱步骤,获得融合标签表达的蛋白及其复合物。

利用InterPlay TAP系统提供的系列载体中,研究人员可以选择将SBP和CBP融合标签克隆在目的片段的N-端或C-端,载体有3种阅读框形式,更方便进行克隆。系统中配套的纯化-洗脱缓冲液体系与克隆表达载体构成了完整的TAP试剂盒。TAP的整个实验过程包括目的基因与TAP载体克隆,质粒转染到宿主哺乳动物细胞,2步法亲和纯化等三个主要步骤,比较于常规的蛋白相互作用方法更加简便。

目前InterPlay™ N-Terminal MammalianTAP System和InterPlay™ N-terminal Mammalian TAP Vectors分别为人民币16112和9278.5,其实与酵母双杂系统的价格也相差不多,可以考虑一下。

 

2.如何对比较弱的相互作用进行研究?

生物体中有时执行细胞功能的是一些表达量低,与其它蛋白相互作用弱的蛋白质,要对这些相互作用进行分析,Y2H常常不能奏效——酵母双杂是在体内进行分析,因此对于一些低丰度,蛋白相互作用弱的关系就不能准确的描绘,因此需要寻找其它的一些方法。

耶鲁大学基因组与蛋白质组研究中心的Mike Snyder在完成他的一篇发表在《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志上的文章(寻找拟南芥蛋白质组中钙调蛋白CaM和类钙调蛋白CML(calmodulin-like)直接绑定蛋白,PNAS 104:4730-5, 2007)的时候找到了这样一种方法:蛋白芯片方法。

在这篇文章中,Snyder教授等人表达了1133个植物蛋白,并将这些蛋白及拷贝放置于硝化纤维膜包被玻片上,进行蛋白芯片研究,然后利用7种荧光标记的CaM和CML蛋白作为探针,结果发现了173个蛋白伴侣。

Snyder的实验室在蛋白芯片研究方法处于世界领先位置——曾于2001首次描绘了酵母蛋白质组芯片。Snyder认为芯片实验具有几个优点,首先由于是体外实验,因此观察到的相互作用都是直接作用的,有中间介导的是不会出现的;第二,芯片能进行结合强度的直接比较,将相互作用强弱进行排行——这是其它方法获得的数据无法比较的;最后由于芯片上所有蛋白都是相同的数量,因此可以检测到拷贝数非常低的蛋白相互作用。

但另一方面,也正是由于芯片探针是体外进行的反应,因此结果需要在体内进行验证,而且芯片实验可能对于一些研究人员来说确实比较贵和操作上比较繁琐。

目前商业性的蛋白芯片产品比较少,Snyder实验室将他们的专利授权给了Invitrogen,由此Invitrogen创造出了Protoarray系列产品。其中Yeast ProtoArray™ PPI (Protein-Protein Interactions) microarray就是一种在蛋白组水平上阐明蛋白之间的相互作用的高密度蛋白微阵列。

相比较与Y2H,ProtoArray不需要花费数周时间,由于所有的酵母蛋白固定在玻片上,因此可以在一次实验,短至4小时内针对酵母蛋白组筛选标记的目的蛋白,以阐述针对超过4000种蛋白的蛋白相互作用,基本过程包括:封闭(1小时),加入生物素标记的探针;洗涤(10分钟),加入Alexa Fluor® 647耦联的链霉亲和素检测(30分钟);洗涤、干燥和扫描(1小时)。

ProtoArray的一个重要就是确保对相互作用的最大搜索,我们都知道,保持芯片蛋白处于有相互作用功能的状态是利用这种方法研究蛋白相互作用的重要前提,但是要所有蛋白都保证这一点是不可能的。为了能尽可能达到这个要求,ProtoArray在芯片波片上包被上了硝化纤维,而已知硝化纤维与种类广泛的蛋白功能相兼容,这一点Invitrogen的技术人员进行了确认(详细内容可见invitrogen网站)。

而且ProtoArray可以在不同条件下分析蛋白相互作用,阐述动态的相互作用,比如使用不同蛋白修饰状态如磷酸化或者糖基化,不同的蛋白浓度,或者改变反应条件如离子强度,pH值或者温度,添加辅助因子(cofactor)如二价阳离子,这些不仅可以帮助检测出各种蛋白相互作用,而且可以更加精确地了解正在研究的相互作用的生物化学原理。

另外,正如上文提及的,ProtoArray是以Snyder实验室来源于酵母收集库的优良蛋白基础上建立的,这个收集库是由克隆到5’GST融合的酵母表达载体的开放阅读框,通过融合GST标签,蛋白可以很容易地在天然状态下,以高通量的方式快速纯化,可以收集到更多功能蛋白。

除此之外,针对假阳性的问题,ProtoArray在每一个microarray上设立了对照,此外还有背景、标记和检测对照也被印记到每一个玻片上。这些对照提供了额外的信息,确保对结果的自信。

Invitrogen目前还推出了ProtoArray human microarray V4.1,蛋白分析数量高达8000个,是进行大规模人类蛋白相互作用分析的首选之一,价格约为1700美元。

(生物通:张迪)

优化蛋白相互作用实验(二)

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