逆转生命时钟：诱导性多能干细胞

　　

作者:周一叶　曾凡一　曾溢滔 

    生命是怎样生生不息的？包括人类在内的生命体，又是怎样由一个受精卵发育为一个有血有肉、有五脏六腑的成体的？这个过程是如何组织协调的，能不能逆转呢？一直以来，为了医疗需要和理论探索，人们致力于通过各种途径获得拥有类似胚胎的强大发育潜能的特殊细胞——干细胞，但同时又被各种技术瓶颈和伦理问题所困扰。近期美国和日本科学家取得重大突破，美国《细胞》（Cell）杂志、《科学》（Science）周刊与英国《自然》（Nature）杂志连续发表论文，指出小鼠和人的皮肤细胞能被一些特殊的因子诱导，逆转为类似胚胎细胞的状态，  并已经取得初步的治疗成果，引起了学术界和公众的极大反响。

 

      发  育  与  分  化

      受精卵发育之初，通过有丝分裂，一分二、二分四、四分八，但是八细胞之后，细胞的增殖就不再是简单的复制，而是通过彼此的影响产生分化，选择了不同的命运。它们的后代又继续在分化的道路上越走越远，在发育过程中，细胞一边增殖一边分化，最终在成熟的个体中，不同组织器官中的细胞形态功能差别极大。

      细胞表型（外观和功能）是由这个细胞表达的蛋白质决定的，而对于每个细胞来说，蛋白质虽然是由基因决定的，但又不完全由基因决定。根据遗传学中心法则，基因DNA首先转录为RNA，  RNA再翻译为蛋白质。但这个过程并非同步，在不同的细胞中，每一步都受到不同的调控，从而决定了每个细胞中表达蛋白质的千差万别。根据经济化原则，最普遍的调控通常发生在第一步，即转录水平，一般受到各种信号转导途径的指导。这些信号有的来自社会大环境（神经信号和激素），有的来自细胞微环境（自分泌、旁分泌等）。以人类基因组为例，拥有2万多个基因，但只有3%左右的基因表达，此外97%大多是控制基因表达的调控序列。即使这3%的基因，也并非在所有细胞中均表达。在每个细胞中，每个具体基因的“打开”（转录）和“关闭”（不转录）状态，正是由97%的调控序列和细胞外部环境共同决定的，不同的细胞拥有不同的基因表达谱，从而导致了细胞的不同表型，也就是说产生了细胞的分化。

      细胞的分化与它所处的微环境（niche）密切相关。每个细胞的基因都是全能的，但是由于它成长发育过程中的具体环境，不断面临着分化方向的选择，而这种选择又影响到将来的发育途径中的下一步分化。分化的本质是一些特定基因的打开或关闭，而这些基因可能起到控制阀门的作用，进一步影响发育下游基因的表达。

      而细胞又是怎样记忆和调整自己的分化状态，怎样标记哪些基因打开，哪些基因关闭呢？原来，在特定发育时间和部位，一些特定的甲基化或乙酰化等基团修饰会被加到基因组特定区域的DNA或与DNA普遍结合的组蛋白上，称之为“表观遗传修饰”，细胞核从而获得“记忆”。例如通常DNA甲基化后的空间构象导致DNA与辅助转录的蛋白结合困难，从而标记基因“关闭”；而组蛋白乙酰化使得组蛋白结构变得更松散，使DNA更容易与辅助转录的蛋白结合，从而标记“打开”，进而调节相关基因的表达，导致细胞不断分化。这个分化的过程，就对应着从全能干细胞（8细胞期前）→多能干细胞（囊胚）→单能干细胞、祖细胞、前体细胞→终末分化细胞（成体）的发育途径。最终，成体体内除生殖细胞外，其余绝大部分细胞分化为无法继续分化的终末分化细胞，称为“体细胞”。

 

      重编程与诱导性多能干细胞

      与终末分化状态的体细胞相对应的，就是胚胎阶段具有神奇的发育多潜能性的“干细胞”。它们不但可以通过细胞增殖维持自身细胞群体的大小（即自我更新能力），而且具有很多潜能，可以进一步分化成为各种不同组织细胞的前体细胞（progenitor），进而生成各种复杂的组织器官。目前，囊胚中的内细胞团已被分离并在体外培养建成胚胎干细胞系（embryonic  stem  cell，ES  cell），它们有望成为实施器官再生医学和现代生物细胞疗法的重要细胞来源，将为目前大量不治之症（如神经退行性疾病、癌症、器官移植和损伤再生等）的发病机理和治疗学提供研究途径。但是ES细胞只能从早期胚胎获得，因此病人通常无法获得自身的ES细胞，用他人的ES细胞治疗又存在移植后免疫排斥的难关，同时又饱受伦理问题的困扰，因为获得一支体外ES细胞系，必须以破坏一个甚至更多早期人类胚胎为代价。

 

      逆转生命时钟：诱导性多能干细胞　

      近10年来，科学家又在成人的骨髓、神经、肌肉和脂肪组织等多种组织中发现了极少量具有有限分化潜能的成体干细胞（adult  stem  cell，ASCs）。成体干细胞的发现可解决胚胎干细胞免疫排斥和伦理学问题，但即使在健康人体内组织中，它们的分布都极其稀少、鉴定困难而且难以追踪，而分离病人自身的成体干细胞用于治疗就更加困难。

      1997年多利羊的成功克隆，首次发现除了生殖细胞外，高度分化的体细胞也可在一定条件下恢复多能性甚至全能性状态并发育为完整的新个体，揭示了生命是一个生生不息的循环，所有的表观遗传修饰标记可以被抹去，“归零”回复到原始状态，从而展开全新的发育历程。这个发育和分化程序被逆转（重编程）的现象引起生物学家和医学界极大的兴趣，“治疗性克隆”的概念也应运而生。“治疗性克隆”是指将病人皮肤细胞移植到人类卵母细胞中，获得的胚胎在囊胚阶段时被破坏，获取病人个体特异的胚胎干细胞，在体外扩增培养并诱导分化后注射回病人体内进行治疗，可以排除免疫排斥的问题。然而人类的卵母细胞极其珍贵，难以获取，而进行体细胞核移植对设备和技术要求都很高，成功率又很低，同时难以避免种种争议极大的伦理问题，导致在研究资金上受到诸多限制。这些原因致使治疗性克隆一直未取得实质性的突破，但取材病人皮肤进行重编程从而得到多能干细胞的美妙设想却已深入人心。

      在不断的摸索中，科学家发现体细胞可以通过两种手段重编程为多能干细胞，一种是将体细胞移植入去核卵母细胞，另一种是将体细胞与ES细胞融合，目的都是将高度分化的细胞核充分暴露在卵母细胞或ES细胞的细胞质中。那么在这两种细胞质中，究竟有什么神奇的因子能够实现生命的逆转，重新赋予成熟的体细胞核巨大的发育潜能呢？科学家们将眼光投向近年来广泛报道的一些多能性因子，它们大多在ES细胞中特异表达，并对ES细胞多能性的维持起关键作用。

      日本京都大学的山中伸弥（Shinya  Yamanaka）研究组选定了24个候选因子，并将它们的互补DNA（cDNA）序列分别装入逆转录病毒载体，感染小鼠胚胎成纤维细胞，经细胞克隆（就是将单个细胞从细胞群中分离出来单独培养，使之重新繁衍成新的单一细胞群，未经克隆化的细胞具有异质性，经过克隆得到的是均一细胞集团），结果发现其中4种基因的组合感染小鼠胚胎成纤维细胞后，存活克隆的形态与生长特性都与胚胎干细胞十分类似，并且表达ES特异细胞标志[2]。山中伸弥将这种细胞命名为诱导性多能干细胞（induced  pluripotent  stem  cell，iPS  cell）。将iPS细胞注射到裸鼠腹腔可得到包含三胚层细胞的畸胎瘤，进一步证明它具有类似ES细胞的发育潜能。2006年8月25日，该研究发表于《细胞》杂志上。

      2007年，美国麻省理工学院的耶尼施（R.  Jaenisch）研究组独立验证了iPS实验，并且发现了iPS细胞能通过有性繁殖而传递[3]。研究组进一步将iPS细胞注射进四倍体囊胚（无进一步发育能力的胚胎），所得到的“纯iPS来源”的小鼠胚胎，能够存活到胚胎晚期但无法存活至出生。

      随后，人类体细胞也被成功诱导为多能干细胞。山中伸弥研究组利用慢病毒载体将曾诱导出小鼠多能干细胞的4种基因分别转入胎儿、成人和老年人皮肤细胞，得到类ES细胞克隆，基因组中4种基因各有3～6个整合位点[4]。美国威斯康星大学的汤姆森（J.  Thomson）研究组独立从14种ES高表达基因中筛选出4种基因，也得到相似结果[5]。

      由于体细胞诱导的成功率仅在10-3～10-5，令人怀疑iPS细胞是不是实际上来自皮肤成纤维细胞中混有的极少量成体祖细胞？为了排除这个可能，美国波士顿儿童医院戴利（G.  Daley）研究组将成纤维细胞用慢病毒转染诱导后，梯度稀释为单细胞悬液。待克隆生长后，检测到每个细胞具有相同的整合位点，证实它们来源于单个成纤维细胞，排除了iPS细胞来自成体祖细胞的可能[6]。

      iPS细胞是否真正的多能干细胞？这是目前iPS研究的核心。人们从细胞表型、表面标志、表观遗传状态、基因表达模式和发育潜能等方面对其进行了一系列鉴定，发现iPS细胞各方面均类似ES细胞，而与转染前的成纤维细胞差别较大。

 

      外源因子的诱导作用与重编程的机理

      在稳定传代的iPS细胞系中，整合的外源基因出现转基因沉默，意味着它们的表达仅仅用来启动体细胞的重编程，并非用以维持多能性；而多能性的长期维持依靠的是外源基因重编程激活的内源多能基因表达，特别是内源Oct-4和Sox2的持续性表达上调[5]。重编程的具体过程牵扯到胞内多部位多水平的复杂变化与关联，其中最重要的是DNA和组蛋白修饰的变化。

      这些重编程的通路是互相关联、互为因果、互相呼应的，而将体细胞诱导为多能干细胞的关键就是找到打开重编程通路的钥匙。山中伸弥研究组和汤姆森研究组使用的4个外源因子中，有两个相同的基因Oct-4和Sox2，而在他们都发现在各自的诱导体系中只有Oct-4和Sox2对重编程是必需的，其余的不同因子仅仅是从转录和翻译水平放大重编程效用，提高重编程效率，说明体细胞重编程的信号通路既有相对独立的分支又有必经的总干道。

 

      iPS细胞的临床应用和社会价值

      目前，iPS细胞已经初步用于治疗，2007年12月6日美国《科学》周刊宣布，把iPS和ES细胞诱导分化为造血祖细胞，移植到小鼠体内能修复致命辐射带来的损伤。人们进一步将其用于患有镰状细胞贫血症的小鼠的基因和细胞治疗。培养患病小鼠自身的皮肤细胞并诱导为多能干细胞，导入正常的hβA基因，再在体外诱导为造血祖细胞，移植给小鼠12周后检测到大量正常βA蛋白，各项血液学指标趋于正常，典型症状如红血球大小不等、异形红细胞等均有所改善[7]。

      iPS研究之所以在短时间引起巨大的关注，不仅在于它的科学价值，还因为它可能从根本上解决了干细胞研究的伦理问题。人类iPS细胞公布当天，美国白宫发表欢迎声明，认为这才是干细胞研究的“正道”，而之前美国总统布什已两度否决了放宽干细胞研究资助限制的法案。

      汤姆森是率先从囊胚中分离人类胚胎干细胞的科学家之一。近年来干细胞的研究及应用几乎涉及了所有生命科学和生物医药领域，而最经典的干细胞——ES细胞虽然有巨大的发育潜能和应用前景，却需要破坏发育至囊胚期的胚胎（受精后7天）才能获得，遇到极大的伦理和法律障碍。在比较保守的宗教和价值观里，破坏囊胚等同于杀死生命，不同的信仰、价值观和文化背景甚至不同的学科对生命的界定标准不同，因此干细胞研究成为近年来最为激烈而敏感的伦理争议之一[8]。

      巧合的是，十年后又是汤姆森和山中伸弥为此提供了解决方案，成纤维细胞诱导为多能干细胞，原始材料只需要病人的一小块皮肤，经过诱导后既有类似ES细胞的发育潜能，又无免疫排斥问题，而且避免了获得手段的伦理问题。然而iPS研究只有短短一年多的历史，还有许多问题尚待解决。体细胞诱导成功率低，外源基因的逆转录活性有可能重新激活，带来很大的不安全性，此外，慢病毒载体随机整合入体细胞基因组，可能会导致整合位点处有用基因的破坏或致病基因被激活。由于这4种基因只是负责打开重编程的开关，并不需要持续表达，如果改用4种基因对应的蛋白、mRNA或者质粒瞬时转染，或许可以找到更安全的诱导方案。

      现阶段iPS还不能完全取代传统干细胞研究，传统的ES细胞仍然是人们理解、分析iPS以及研究其疗效的黄金标准。iPS细胞短时间内实现从小鼠到人类的突破，说明细胞重编程受物种的影响大大低于克隆的个体重编程，但是iPS细胞至今未获得存活的纯种后代，说明重编程程度仍然受限制，或许还缺乏一种或几种必要的诱导物。iPS研究的进展标志着人类已经可以倒转细胞分化的“时间之钟”，如果进一步鉴定诱导重编程的确切物质，将越来越接近于彻底揭开生命循环的秘密。

 

      [1]  Okita  K，Ichisaka  T，Yamanaka  S.  Generation  of  germline-competent  induced  pluripotent  stem  cells.  Nature，2007，448：313.

      [2]  Wernig  M，  Meissner  A，Foreman  R，et  al.  In  vitro  reprogramming  of  fibroblasts  into  a  pluripotent  ES-cell-like  state.  Nature，2007，448：318.

      [3]  Takahashi  K，Tanabe  K，Ohnuki  M，et  al.  Induction  of  pluripotent  stem  cells  from  adult  human  fibroblasts  by  defined  factors.  Cell，2007，131（5）：861.

      [4]  Yu  J，Vodyanik  M  A，Smuga-Otto  K，et  al.  Induced  pluripotent  stem  cell  lines  derived  from  human  somatic  cells.  Science，2007，318：1917.

      [5]  Park  I  H，Zhao  R，West  J  A，et  al.  Reprogramming  of  human  somatic  cells  to  pluripotency  with  defined  factors.  Nature，2007，451：141.

      [6]  Hanna  J，Wernig  M，Markoulaki  S，et  al.  Treatment  of  Sickle  Cell  Anemia  Mouse  Model  with  iPS  Cells  Generated  from  Autologous  Skin.  Science，2007，318：1920.

      [7]  Gilbert  Scott  F.  Developmental  biology.  8th  ed.  Sunderland：Sinauer  Associates，2006.