microRNA研究实验导航[选购宝典]

【字体: 时间:2008年02月26日 来源:生物通

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  近两年microRNA的研究受到越来越多科学家的关注,大量的实验结果揭示了microRNA在胚胎发育、癌症等方面起到非常重要的调控作用,据推测microRNA可能调控至少30%的基因的表达情况。

  近两年microRNA的研究受到越来越多科学家的关注,大量的实验结果揭示了microRNA在胚胎发育、癌症等方面起到非常重要的调控作用,据推测microRNA可能调控至少30%的基因的表达情况。

  如果您也想开展microRNA的研究,该如何下手了?首先你需要知道在你感兴趣的研究领域里到底有哪些miRNA是活跃分子,幸运的话通过阅读发表的文章就能锁定一些miRNA分子,否则需要做一个miRNA表达谱芯片分析来初筛出有研究价值的那些miRNA。表达谱芯片的原理简单的说就是把待测样品中的miRNA与芯片上互补的探针序列杂交,通常待测样品中的miRNA 3'端会标记上荧光基团,杂交洗涤后可扫描荧光强度,大量数据处理后便可筛选出有显著表达差异的miRNA,这些“脱颖而出”的群体就是你要瞄准的研究对象了。

  接下来,需要精确检测这些miRNA在你研究的细胞或是组织样品中的表达水平了,你可以收集大量的标本筛出biomarker,或是采用多种条件刺激样品来阐述信号通路。由于Northern blotting涉及到的步骤较多、耗时长、难以精确定量,这里介绍更快速简单并且能精确定量的检测miRNA的方法 — real-time PCR,针对miRNA的real-time PCR与常规的real-time 有所不同。

  目前有的公司提供的是探针法试剂,有的是SYBR Green法试剂,因探针法试剂成本较高,生物通在此挑选出SYBR Green法的代表作 — QIAGEN公司的完整的一套miRNA定量试剂miScrip system来介绍,这次比起其他进口品牌同系列的产品,QIAGEN价格倒是不贵。

  第一步是miRNA的提取,核酸提取无疑是QIAGEN公司的绝活,对于miRNA这样的小分子,QIAGEN自有妙招,即便是FFPE组织标本,采用经典的硅胶膜选择吸附离心柱,配上优化好的各种buffer,可以快速纯化出所有大于18个核苷酸的RNA。另外还提供Protocol用于单独富集<200nt的小RNA,在芯片分析时也许能降低背景信号,不过在real-time PCR实验中倒是用不着。

  第二步是逆转录反应,这里就有别于普通的针对mRNA的RT反应了,因为真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,这样Oligo-dT逆转录引物就很容易结合到mRNA上来合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴,于是QIAGEN的对策就是在RT kit里加了poly(A) polymerase先给那些无poly-A尾巴的RNA分子加上一串A尾巴,然后用带有一段通用序列(universal tag)的Oligo-dT及RT酶来合成cDNA。这样设计的一个好处就是一次RT反应合成了所有miRNA分子以及其他小RNA、mRNA对应的cDNA,接下来想用来检测什么都可以,细细算来省了不少特异引物和多次RT反应的钱呢!整个RT反应操作也是非常简单,加入预先混好的酶,37℃孵育60min,95℃孵育5min即完成cDNA合成。

  最后一步就是取出一点cDNA为扩增模板,加入正反引物和real-time PCR 试剂盒中的酶预混液及buffer就可以开始热循环了。正反引物中有一条是特异性的miRNA引物,针对人、小鼠、大鼠95%以上miRNA的特异性引物QIAGEN已经设计好了,免去你自己设计优化的烦恼,可以通过他们的网站www.qiagen.com/GeneGlobe查询定购;另一条引物是通用的引物,包含在real-time PCR试剂盒里面。如果你还想检测其他小RNA或是mRNA的表达水平,只需加入相应的扩增引物就行,可谓一款试剂多种用途。

  实验进行到这里,只是在进行miRNA量变的研究,更进一步可以升华到某些特定miRNA功能的探索,采用类似RNAi沉默技术,miRNA同样可以被沉默或者高表达,QIAGEN提供miRNA Inhibitors和miRNA Synthesis 产品来分别完成,详细的实验方案请见下回分解。

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