生物通技术盛宴8:蛋白研究之质谱选择[选购宝典]

【字体: 时间:2008年02月27日 来源:生物通

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  涉及到蛋白质组学分析的研究人员都知道蛋白质组学研究的技术路线有两条,一条是以双向电泳加生物质谱的方法鉴定生物体系中各种蛋白的表达谱以及各蛋白表达程度的相对变化,另一条路线就是多维色谱与生物质谱相结合的称之为鸟枪法的技术路线。其中质谱分析技术(Mass spectrometry,MS)是蛋白质组学常用的研究手段,这是一种通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的方法,由离子源、高通量分析仪和检测仪组成的体系。

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涉及到蛋白质组学分析的研究人员都知道蛋白质组学研究的技术路线有两条,一条是以双向电泳加生物质谱的方法鉴定生物体系中各种蛋白的表达谱以及各蛋白表达程度的相对变化,另一条路线就是多维色谱与生物质谱相结合的称之为鸟枪法的技术路线。其中质谱分析技术(Mass spectrometry,MS)是蛋白质组学常用的研究手段,这是一种通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的方法,由离子源、高通量分析仪和检测仪组成的体系。

有关质谱分析的原理特点,请参照蛋白质质谱分析文章内容,近年来随着质谱技术应用的推广,造成了这一领域多选择性的产品,专业性的术语,这也就无形中增加了研究人员选择合适于他们的系统的困难性。在质谱方法的选择方面,可以考虑分为Protein Chemist级、灵敏级、边缘分析级、混合分析级和计算分析级。

 

1.Protein Chemist级

对于protein chemist而言,需要得到的仅仅就是知道研究的是什么。通过分析一种蛋白的免疫共沉淀的成份,或者利用二维电泳识别特殊的蛋白斑点,protein chemist就可以了解这种蛋白质的生物学特性了。对于这种应用,快速而并不需要太精确的方法就可以满足需要了。

推荐系统:MALDI+TOF

理由:肽指纹图谱(PePtide Mass Fingerprinting,PMF)和基质辅助激光解析电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight,MALDI-TOF)质谱是可以考虑的首选方法。

TOF是一种简单的质谱分析系统,灵敏度高,能进行从10原子质量单位到上百上千单位的片段分析。另一个TOF的优点就是分析的速度,伊利诺斯大学的化学副教授Neil Kelleher就表示“这就是它为什么能与MALDI配合工作的原因,你可以以一种高重复率在激光上操作,每秒获得许多光谱。”

而MALDI则是一种首先就可以考虑的方法,但是并不适合任何人,来自华盛顿大学的化学教授,Journal of the American Society for Mass Spectrometry杂志的编辑Michael Gross就说,“如果你的免疫共沉淀中有20或30个蛋白,每一个有50条特殊带,那么你就有1000条带,利用MALDI并不能在气相中打到全部的”,为了得到更多的信息,必需要考虑一个可以提供序列详细信息的任意构造,比如MALDI-TOF-TOF,或者一个更加灵敏的仪器——离子捕获。

2. 灵敏级

难题总是出在事实本质的详细内容当中,对于蛋白而言,那就是指翻译后修饰了。比如说,假设你正在研究包含有乙酰化和三甲基化修饰的组蛋白,但是一个标准的质谱也许无法区别出这两种修饰,这时就需要高精度的仪器了,这种仪器能获得二位或者四位小数位的报告。

推荐系统:LC+ESI+FTICR with ECD 

理由:准确度高的仪器可以区别对于所谓的正常(nominal-mass)仪器而言相同的分子,一般认为选择液相色谱(liquid chromatography,LC)与电喷雾电离化(electrospray ionization,ESI),以及傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)相结合能达到高精度和高灵敏度的要求。也许还需要电子捕获解离技术(electron capture dissociation,ECD)来获得可重复的结果。

虽然经典的碰撞诱导解离技术(collision induced dissociation,CID)介导的串联质谱方法可以进行斑点修饰(spot modifications),但是对于识别包含了修饰的蛋白残基而言,这并不是一种理想的方法,这主要是由于解离蛋白的时候常常会降解多肽的蛋白修饰,然而ECD则可以保持这种修饰的完整性。不过来自辛辛那提大学的Patrick Limbach提出一个忠告:这些仪器偏差范围小,因此可能会丢失掉一些未预期到的情况,比如天冬酰胺残基的脱酰胺,或者磷酸化。

3.边缘分析级

并不是每一人都对蛋白质感兴趣的,比如说,也许你想知道的是一种特殊的核酸是否包含了不同寻常的或是修饰了的残基(比如methyl-C),以及这些序列定位在那儿。回到这两个问题也许就需要利用到LC-ESI串联质谱(LC-ESI-tandem mass spec),对于前面那个问题需要在负电荷模式里——因为核苷酸是带负电荷的,而后者则需要正电荷模式。

推荐系统:LC+ESI+ION TRAP 或 QUAD+TOF

推荐理由:Limbach博士在进行其核酸实验的时候使用的是LC-ESI线性离子阱(LC-ESI-linear ion trap),LC-ESI-QTOf(quadrupole time of flight hybrid,杂交四矩飞行时间) 质谱两种技术,他指出,“你有哪种特殊的串联质谱并不是关键问题,关键是你需要哪种串联MS功能”,比如要想完成能识别修饰,以及确定多聚核苷酸链中修饰定位在哪儿这两项任务。在这种串联质谱模式中,可以检测离子,降解(比如CID或ECD),然后获得序列以及结构的信息,但是串联质谱并不是都一样的。来自Scripps研究院的细胞生物学家John Yates表示,线性离子阱速度很快,“要比QTOf快许多,但是分辨率和质谱精度要低一些”。但这两种相对于FTICR仪器而言,都是比较便宜的选择。这些都是值得推荐的质谱方法,当然也要考虑相对慢和灵敏度低的缺点,因此需要一个超导磁(superconducting magnet)和有经验的操作人员。

4.混合分析级

对小分子代谢物(比如糖类,脂质)进行详细的分析需要一套不同的仪器设备,也许你就在这个探索的过程中——寻找一种特殊疾病或者药物有效性的生物标记,那么你需要的是能明确得到化学结构的串联质谱分析能力,可供选择的就是LC-ESI-triple quad。但更重要的是,你还要借助多离子方法撒开更广的网,因此我们可以考虑两种选择:APPI(大气压光离子,atmospheric pressure photoionization),和APCI(大气压化学电离,atmospheric pressure chemical ionization)。

推荐系统:LC+ESI+triple quad with multiple ionization sources

推荐理由:APCI可以利用溶剂中的化学成份使样品电离,Limbach表示,“比如说我有一个样品在甲醇/水的溶液中,(APCI)就可以利用甲醇或者水分子发生化学反应电离样品,这样透射入光,光化学产生离子”,当然正如MALDI和电喷雾不能精确电离同样的分子,APCI和APPI也不行。

5. 计算分析级

一旦你识别了所需的生物标记,也许就需要在成百上千的生物样品中对其进行评估计算,可以考虑的定量应用分析仪器就是triple quad——与液相色谱和电喷雾离子化串联使用。Gafken就认为,“triple quads的关键用途就是真实定量,虽然有许多对蛋白和多肽进行定量,但是如果你需要的是绝对定量,那么最好的方法就是triple-quad仪器。”

推荐系统:LC+ESI+triple quad with single or multiple reaction monitoring

推荐理由:Limbach认为,“Quadrupoles(四极)实际上是滤波器,就像是无线电装置一样运转:你调出一个频率,就会有一个特殊的离子传出,这样你就可以扫过这些无线电转盘(radio dial)获得离子,其它的一切都会被剔除”。这些仪器的优势就在于可以进行一个或两个离子频率的扫描(即质荷比(mass-to-charge),m/z),缺点就是对于在许多研发模式工作中需要的高m/z扫描而言太慢了。

但是怎么知道所观测到的离子就是你想要的呢?在任何生物样品中,几个离子也许有相同的m/z值,这就需要single-reaction monitoring介入,Gross认为,“这就能克服第一quad和扫描的慢速问题,因为你知道什么是你想要的”,比如说你的特异分子有m/z1000,m/z300片段离子,你就可以设置第一quad为m/z1000滤波器离子,在第二个quad中将其断裂,然后在第三个quad中对其进行计算(m/z300)。而在multiple reaction monitoring,则可以将仪器设置成“hop”——从一个m/z值到另一个,因此可以同时计算2个,或者3个分析组。

 

在质谱技术研究领域,大家耳熟能详的其实也就那么几个品牌:蛋白经典分析技术专家的GE公司(原Amersham),世界领先的分析设备制造商Thermo(现赛默飞世儿公司),来自于惠普的安捷抡科技公司,以及近年来高调进入质谱领域的ABI公司。

GE的Ettan系统是一个经典的蛋白质(组)学研究体系,在此基础上发展而来的液相色谱-质谱联用系统,MALDI,TOF,LC-ESI串联质谱,ECD等等都是实验室常见的技术仪器。其中Ettan ESI—ToF将LC液相色谱系统与ESI—ToF质谱仪完全整合为一体(可利用UNICORN软件同时控制整个系统),灵敏度高(<5pg),准确度高(<5 ppm),检测分子量远大于150 KD,分辨率达到了5000 FWHM,线性范围10000,检测速度极快100谱图/秒,并且LC组份可在进入ESI—ToF之前自动去盐,浓缩,实验完成后可获得Oracle数据库,与功能强大的分析软件Profound相配套,得到谱图后,可自动进行肽指纹分析。

而赛默飞世儿的Proteomicsn质谱仪组几乎可以涵盖蛋白组学的应用,从由上向下的分析到由下向上序列测定,从高通量的蛋白鉴别到自动蛋白定量,还可用于发现生物标记,是鉴别和验证蛋白生物标记的有效手段,包括一些特殊病的标记。Proteomicsn质谱仪组核心是三个专利质谱仪:超高灵敏度和用于蛋白鉴别的Finnigan LTQ、具有高分辨率和精确用于测定蛋白和变体Finnigan LTQ FT和用于高通量自动凝胶斑点分析的Finnigan vMALDI shiLTQ。这个质谱仪组也可以使用SEQUEST Sorcerer和ProSight PTM软件包,SEQUEST Sorcerer软件可以加速蛋白数据库的搜索,节省研究人员的搜索时间,从而更快的得到结果。ProSight PTM是一专用软件包,是一个由上向下的蛋白质顺序分析软件,适合质谱仪Finnigan LTQ FT。

2007年赛默飞世儿在全美质谱大会(ASMS)上推出全新基于LTQ Orbitrap平台的LTQ Orbitrap Discovery™ 和 LTQ Orbitrap XL™。这两款组合质谱仪实现了超高质量精确度,分辨能力,动态范围和灵敏度。无论是蛋白质坚鉴定,亦或是灵敏度,使组合式质谱的分析能力都远超过飞行时间质谱(Q-TOF)。近期加拿大蒙特利尔临床研究所IRCM就利用LTQ Orbitrap XL™获得了疾病治疗和预防领域突破性研究IRCM的Benoit Coulombe博士就表示,“开发出一种高度可靠和有效的研究管道, 以便尽可能详细而又精确的绘制出蛋白质交互作用图,是极其重要的,LTQ Orbitrap为我们做出以前被认为不可能的发现, 提供了决定性的帮助。”

ABI的基因分析技术名冠全球,在基因解析尤其是在人类基因组计划中居功甚伟,这是众所周知的。近年来质谱技术也成为了ABI发展的重点,在质谱领域花大量的人力物力做投资研发,开发出强大、在业界领先的质谱系统。比如液相色谱串联质谱API2000就是一种操作简单的技术产品,这种仪器能自动地进行数据的采集、处理与分析,具有专利的气帘技术、离子源接口的新设计,能保证了耐用性,并且专利的高压碰撞聚焦四极杆保证离子的最大传输率,另外线性加速碰撞LINAC技术也能有效消除传统四极杆质谱仪的记忆效应,并提高灵敏度,TurboIon Spray、APCI、APPI多种离子源选择,分析覆盖面广。

当然蛋白的基团越大,质谱检测的准确率就越低,因此在质谱检测之前需要将蛋白消化成小分子的多肽,用以提高质谱检测的准确率,一般而言,6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现在最常用的酶是胰蛋白酶(Trypsin),能在蛋白的赖氨酸和精氨酸处将其切断。但是胰酶消化样品是一件耗时耗力的活,而且常常成为质谱仪分析前的瓶颈。

Sigma-Aldrich推出的Trypsin Spin Column(胰酶螺旋柱)能够将消化复杂蛋白混合物的时间从传统方法的18小时缩减到15分钟,这种螺旋柱(Proteomics Grade)含有高纯度的TPCK处理的猪胰酶(trypsin),并且固定在一个经化学修饰的二氧化硅支架来使非特异性的吸收最小化。这使得能在一步完成蛋白质的酶消化,制备好质谱仪所需的样本。这种柱子可用于分析10-100微克的样品。消化15分钟后,洗涤肽片断,以备MS分析,不需要另外清洗,而且获得的MS数据的质量与传统消化方法获得的数据质量相同,甚至更高。所以想节约时间的研究人员可以考虑下这种新的胰酶处理仪器。

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