新一代阳离子聚合物转染试剂（梭华-Sofast）转染效果研究[创新技巧]

 新一代阳离子聚合物转染试剂（梭华-Sofast）转染效果研究



杨天赐¹ 陈明桥²    黄革玲³

（1厦门大学生命科学学院生化与分子生物学实验室，福建 厦门 361005；2莆田市中心血站，福建 莆田 351100；厦门市妇幼医院，福建 361000）



摘要：本文采用DNA延滞实验研究梭华-Sofast与DNA的结合能力，以不同报告基因（绿色荧光蛋白基因、b-半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因），分析比较梭华-Sofast 与阳离子脂质体Lipofectamine 2000和阳离子聚合物Jet PEI、Superfect转染HEK293细胞转染效率和细胞毒性，研究新一代阳离子聚合物梭华-Sofast转染试剂转染效率。实验结果表明梭华-Sofast与DNA有很强的结合能力；以绿色荧光蛋白基因为报告基因，梭华-Sofast转染率最高，约60%左右，而且在单个细胞中表达的GFP量多；转染细胞荧光素酶活性检测结果表明，当梭华-Sofast与DNA重量的比为16时，转染率最高，高于109 RLU/mg蛋白，分别是Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000转染细胞最高活性的1.6, 2.3和5倍；梭华-Sofast转染b-半乳糖苷酶的染色结果显示95%以上的阳性细胞转染率；比较基因转染效率最高时的细胞毒性，在最佳转染剂量时，几种试剂的细胞存活率均在83%以上，而梭华-Sofast为94.23%。在目前市场上销售的转染试剂对HUV-EC细胞的转染效果均不理想情况下，梭华-Sofast仍具一定的转染效率，阳性细胞约占20%。研究结果表明梭华-Sofast是一种高转染效率，低细胞毒性的转染试剂。

关键词：梭华-Sofast 转染 细胞毒性 HEK293 阳离子聚合物

中图分类号：Q783 文献标识码：A



基因转染是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内，并使核酸在细胞内维持其生物功能”。将基因导入真核细胞的方法有许多，归纳有生化方法转染、物理方法转染、以及病毒介导的转染。病毒介导的转染效率最高，但病毒的安全性问题阻碍了它的推广应用[1]，而且病毒载体制备方法复杂，价格昂贵也严重限制了其在基因转染中的应用[2]。利用生化的方法进行的转染如早期的磷酸钙转染法，其转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。80年代中期建立的阳离子脂质体介导的转染法，在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜，在体外基因转染中有很高的效率，且操作简便，一度成为主要的转染试剂。然而，阳离子脂质体在体内使用时，它迅速被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应[3]，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用[4,5]。新一代转染试剂阳离子聚合物，具有高效率转染所必备特征，如浓缩DNA，将DNA运送到细胞内，并使其在细胞核内释放等，且细胞毒性很低，很稳定，不被血清清除等特点，而日益受到重视。

梭华-Sofast（以下简称Sofast）基因转染试剂是最新一代的阳离子聚合物转染试剂的代表。为了研究Sofast基因转染试剂的转染效果，本文使用不同报告基因，进行Sofast与最流行的阳离子脂质体Lipofectamine 2000和阳离子聚合物Jet PEI、Superfect转染效率的分析比较，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

转染试剂Lipofectamine 2000购置美国Invitrogen公司，Jet PEI购自美国Qbiogene公司，Superfect购自美国Qiagen公司， Sofast 由厦门太阳马生物工程有限公司提供。质粒pEGFPN1和pCMV-lac Z购自美国Clontech公司，分别含有绿色荧光蛋白基因和b-半乳糖苷酶基因；质粒pGL3购自Promega 公司，含荧光素酶基因。细胞培养液Opti MEM购自Gibco公司。人胚肾HEK293和人脐静脉上皮细胞(HUV-EC)细胞株购自ATCC。荧光显微镜（Olympus 1′70， Japan）；多孔板照度计（DYNEX Technologies , USA）。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人胚肾HEK293细胞株用含10%胎牛血清的DMEM(Gibco)培养，培养液中含青霉素和链霉素各100U/ml。人脐静脉上皮细胞(HUV-EC)用EMB培养液(含血清和多种生长因子)培养。两种细胞放置于37℃，5%CO2孵育箱，在饱和湿度条件下培养。

1.2.2 DNA 延滞实验

首先将20mg质粒DNA(pEGFPN1, pCMV-lac Z和pGL3质粒) 稀释于1000ml Opti MEM（购自Gibco公司）中；分别取浓度5mg/ml的 Sofast 试剂0ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml、64ml、128ml稀释于Opti MEM中，总体积1000ml；然后将上述Sofast 稀释液分别滴加到质粒DNA的稀释液中，使得Sofast和DNA的重量比分别为0、0.5、1、2、4、8、16、32倍，用旋涡振荡器充分混匀，室温温育15min。将500ml的DNA 加样缓冲液加入上述样品中混匀，取15ml样品加入到0.3%琼脂糖凝胶中，100V 电泳30min。在紫外线下观察DNA 电泳图谱并照相。

1.2.3 基因转染实验

将HEK293细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔种植2.0′105个细胞，细胞培养液总体积500ml。将细胞放置在37℃，5%CO2孵育16～24h，细胞密度约40～50﹪。

将0.6mg 质粒DNA(pEGFPN1, pCMV-lac Z和pGL3质粒)和转染试剂分别稀释于30ml Opti MEM中，然后将30ml转染试剂稀释液滴加到30ml质粒DNA的稀释液中，边加边用旋涡振荡器振荡，室温温育15min。其中Sofast和质粒的重量比从32:1 到8:1，其他转染试剂用量参照厂家说明书。

将转染试剂/DNA 混合物（60ml）加入细胞培养液中，轻轻摇匀，置于37℃，5%CO2孵育48h，基因表达分析。

1.2.4报告基因表达分析

1）绿色荧光蛋白（GFP）表达

用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。每孔找3个具有代表性的视野，各观察100个细胞，计算阳性细胞的百分率。

2）荧光素酶活性检测

小心吸去培养液，小心地用PBS洗一遍，加入150ml的细胞溶破液（25mmol/L Tris-磷酸，20mmol/L二硫苏糖醇，10% 甘油，0.15%TritonX-100，pH 7.8），室温放置10min，用旋涡振荡器震动细胞10～15sec。小心取出所有含细胞碎片的溶破液，转移到微量离心管中，4℃离心2min。取出10ml上清，加入到白色不透光的96孔板中，放入光度计中。通过计算机程序设定，每孔加入50ml荧光素酶分析底物（Promega），检测10sec钟内荧光素酶催化荧光素氧化反应所产生光强度，用相对光度单位（RLU）表示。

另取6ml细胞溶破液上清到透明的96孔板中，每孔加入200ml 考马斯蓝蛋白分析试剂 (Pierce, cat#: 1856210)，混匀，用酶联仪测定OD595，同时用BSA标准溶液测定OD595 ，作出OD595-蛋白浓度关系标准曲线，计算细胞溶破液上清的蛋白浓度。荧光素酶活性用RLU/mg蛋白来表示。

3）b-半乳糖苷酶染色

细胞用0.01mol/L的PBS洗涤，用0.4%多聚甲醛固定5min, PBS冲洗后加入5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）染色液(配方为0.04%X-gal, 5mmol/L亚铁氰化钾, 5mmol/L高铁氰化钾和2mmol/LMgCl2), 放置37℃，5%CO2孵育3h。用常规显微镜观察，阳性细胞呈深蓝色。同1）计算阳性细胞的百分率。

1.2.5细胞毒性分析研究

将HEK293细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔种植5′105个细胞/100ml培养液。将细胞放置在37℃，5%CO2孵育培养16～24h。将0.15mg 质粒DNA(pEGFPN1, pCMV-lac Z和pGL3质粒)和转染试剂分别稀释于7.5ml Opti MEM中，然后将7.5ml转染试剂稀释液滴加到7.5ml质粒DNA的稀释液中，边加边用旋涡振荡器振荡，室温温育15min。其中Sofast和质粒的重量比从32:1 到8:1，其他转染试剂用量参照厂家说明书。将转染试剂/DNA 混合物（15ml）加入细胞中，轻轻摇匀，置于37℃，5%CO2孵育培养24h。每孔细胞中加入10ml MTT (Sigma, 5mg/ml)，37℃，5%CO2孵育培养3～4h。小心弃去所有液体，晾干，加入200ml DMSO，溶破细胞。用酶联仪测定OD550。以对照（未转染细胞）的光密度为100%，计算基因转染后细胞存活的百分率。

2 实验结果

2.1 DNA 延滞实验

DNA 延滞实验用于检测转染试剂结合DNA 的能力。在电场中，带负电荷的质粒DNA由负极向正极泳动，在凝胶中显示典型的质粒条带。如阳离子聚合物能够结合DNA，则整个DNA/阳离子聚合物的复合体的负电荷减弱，分子量增大，在电场中的泳动速度变慢，或停止泳动，有时甚至向反方向缓慢移动。

图1为DNA 延滞实验结果。在未加Sofast的情况下（0），出现典型的质粒条带。Sofast和DNA 的重量比为0.5时，质粒DNA电泳速度明显延滞，仅能看到一片不明显的DNA痕迹，Sofast和DNA 的重量比增至1时，仅部分难以分辨的DNA移出原点。当Sofast /DNA比例的增加到2以上，所有的DNA都被结合，在电场中停止泳动。实验结果说明Sofast有较强的DNA结合能力。





图1 Sofast/DNA 复合物的电泳图谱

Fig.1 Gel electrophoresis of Sofast/DNA complexes

图中数值为Sofast和DNA的重量比，0表示未加Sofast ,M为DNA Marker。

2.2基因转染效率

绿色荧光蛋白（GFP ）基因表达的产物GFP能激射峰值508nm的绿色荧光，可于荧光显微镜下直接观察。GFP阳性细胞越多，信号越强，表明转染率越高。研究结果表明Sofast的转染率最高，阳性细胞占60%左右，而且荧光强度最强。其它试剂转染效率约50～55%，比Sofast低约5～10%，而且荧光强度较弱（见图2）。说明用Sofast转染的细胞，不仅阳性百分率高，而且在单个细胞中表达的GFP量多。




图2使用不同试剂转染pEGFPN1质粒后，HEK293细胞的典型荧光照片（100X）

Fig.2 Typical picture of GFP gene transfection by different transfection reagents with HEK293（100X）



荧光素酶（Luciferase）是从荧火虫分离得到的。荧光素酶能够催化荧光素反应生成氧化荧光素，同时分解ATP 并将其中的化学能转化为光能。在适宜的条件下，荧光素酶活性越高，该化学反应产生的光越多。实验表明，Sofast显示最高的转染率，当其与DNA重量比为16时，转染细胞荧光素酶活性高于109 RLU/mg蛋白，分别是Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000转染细胞最高活性的5, 2.3和1.6倍。（结果见图3）。说明Sofast转染效率较其它试剂高。

图3 不同试剂转染pGL3 质粒后，HEK293细胞的荧光素酶活性

Fig.3 Luciferase gene transfection efficiency by using different transfection reagents with HEK293

图标中的数值表示Sofast和DNA 的重量比。对于Superfect 其重量比分别为30，15，7.5,和3.75, 对于Lipofectamine 2000重量比分别为10，5，2.5和1.25。对于Jet PEI N/P 比分别为20，10，5和2.5。



LacZ基因表达的产物为β-半乳糖苷酶，其催化水解反应能把X-Gal 水解成蓝色的5-溴-4-氯-靛青。基因转染后，蓝色细胞越多说明Lac Z gene的转染率越高。比较实验表明，梭华Sofast 转染的HEK 293细胞，95%以上显示蓝色信号，而其它三种试剂转染细胞的阳性率分别为75%，85%和80%。（图 4）



图4 使用不同试剂转染pCMV-Lac Z质粒后，HEK 293细胞用b-半乳糖苷酶底物染色后的典型荧光照片（400X）

Fig.4 The typical picture of b-galactosidase positive cells after lac Z gene transfection by using different transfection reagents with HEK293（400X）



HUV-EC细胞是从脐静脉中分离培养的原代细胞。在本实验中，我们用Sofast，Jet PEI，Superfect和Lipofectamine 2000分别将质粒pEGFPN1转染到HUV-EC中，转染方法与HEK293 相同，但转染试剂/DNA较HEK 293 最高剂量降低一倍。结果表明，Sofast的转染效率最高，阳性细胞约占20%； Jet PEI次之阳性率约10% ，Superfect转染细胞的阳性率在5%左右，Lipofectamine 2000几乎无转染效率（<0.05%），见图5。




图5. 使用不同试剂转染pEGFPN1质粒后， HUV-EC细胞的典型荧光照片（100X）

Fig.5 Typical picture of GFP gene transfection by different transfection reagents with HUV-EC（100X）



2.3细胞毒性实验

在基因转染48h后，我们用MTT法测定了细胞存活率。由于通过基因转染效率实验，我们已经发现各种转染试剂与DNA的最佳比例， 例如当Sofast/DNA 比例为16时，荧光素酶基因转染效率最高（见图5）。我们比较了各种试剂转染效率最高时，细胞的存活率。研究表明，在最佳浓度时，Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000 细胞存活率为分别为91.25%, 87.69%和83. 65%, 细胞毒性很低，而Sofast的存活率大部分94.23%，毒性最低。




图6 用各种转染试剂进行基因转染后HEK293细胞存活百分率

Fig.6 The HEK293 cell livability by using different transfection reagents



3. 讨论

阳离子聚合物作为基因转染载体的研究是从1996年左右开始。它们能够浓缩DNA，促进细胞吞噬聚合物/DNA复合体。由于阳离子聚合物能在细胞内涵体（ENDOSOME）中形成吸收质子的“海绵”，从而使之蹦解，而使DNA 免受内涵体酶解，并使其在细胞核内释放， 从而提高基因表达水平[6]。

Sofast是新型的阳离子聚合物。我们首先用DNA 延滞实验证明，它具有很强的DNA 结合能力，这是转染试剂必需具备的初步条件。在此基础上，我们用绿色荧光蛋白(GFP)，荧光素酶(Luciferase)和b-半乳糖苷酶（b-Galactosidase）三种报告基因比较研究了Sofast，Jet PEI，Superfect和Lipofectamine 2000的转染效率。其中GFP基因和b-Galactosidase基因可以定性分析基因转染效率的有无和高低。相比较而言，GFP基因更为方便，因为GFP蛋白可直接在荧光显微镜下观察；而b-半乳糖苷酶基因较GFP 基因敏感，转染细胞的阳性很高。两种报告基因的检测结果均证明，Sofast的转染效率效率较其它3种商品化转染试剂略高。由于GFP和b-半乳糖苷酶基因只能定性或半定量，因而较难准确地比较各种转染试剂的相对效率。荧光素酶活性检测试剂价格昂贵，但它能很好地进行定量分析。

一般来说，细胞荧光素酶的本底活性为103～104 RLU/mg 蛋白。在本实验中，各种试剂转染的HEK 293细胞的荧光素酶活性均达到2′108 RLU/mg 蛋白以上的水平，说明这几种试剂均具有很高的转染效率。其中Sofast的转染效率分别是Jet PEI，Superfect 和Lipofectamine 2000转染细胞最高活性的5, 2.3和1.6倍，说明Sofast是一种非常好的转染试剂。

对HEK 293这种最容易转染的细胞[7]而言，Sofast较其它市售试剂具有更高的转染率。为进一步探讨Sofast对目前市售试剂难以转染的细胞的转染效果，我们选用人脐静脉上皮HUV-EC 细胞作为研究对象进行研究。结果发现，Sofast的转染效率仍为最高，阳性细胞约占20%；Jet PEI和Superfect的转染效率分别为10% 和5%左右。特别有趣的是，在各种常规转染实验中表现较好的Lipofectamine 2000，在此细胞中几乎没有转染效率。说明Sofast对于某些原代培养细胞来说也是一种很好的转染试剂。由于原代培养细胞种类繁多，对于不同来源细胞，Sofast的转染效率也可能有很大的差异，需进一步研究。

除基因转染效率外，细胞毒性也是一个非常重要的参数。通常细胞毒性的高低用半致死剂量（ID50 或LD50）来表示。考虑到基因转染效率和细胞毒性是密切相关的，即要达到一定转染效率，总会产生一定程度的细胞毒性。比较基因转染效率最高时的细胞毒性更有意义，因为即使某试剂毫无毒性，若其无转染效率，对基因转染研究来说也是毫无意义。本实验的结果表明，在最佳转染剂量时，几种试剂的细胞存活率均在83%以上，说明细胞毒性很低。

以往的实验表明，大多阳离子脂质体对血清很敏感，因而在整个基因转染过程均不能含有血清，因而在转染试剂加入细胞的前后必须更换培养液，以提高转染效率，降低细胞毒性。而Sofast不仅细胞毒性很低，很稳定，因而极为方便。在制备好转染试剂/质粒DNA的混合物后，可以直接加入细胞培养液，然后等待分析转染效率。整个实验可在半小时内完成，而无需等待若干小时更换培养液。

综上所述，Sofast是一种高转染效率，低细胞毒性的转染试剂。而其简单，快捷的实验步骤，在实验研究中具有很好的优越性。



参考文献:

〔1〕 Verma I M, Somia N. Gene therapy—promises, problems and prospects. Nature, 1997, 389: 239ˉ242.

〔2〕 Arhsall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector. Science, 2000, 286: 2244ˉ2245

〔3〕 Ishiwata N, Suzuki S, Ando et al. Characteristics and biodistribution of cationic liposomes and their DNA complexes. J. Control Rel, 2000, 69 : 139ˉ148

〔4〕 Filion M C, Phillips N C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochim Biophys Acta, 1997, 1329: 345ˉ356

〔5〕 Filion M C, Phillips N C. Major limitations in the use of cationic liposomes for DNA delivery. Int. J. Pharm, 1998, 162:159ˉ170

〔6〕 Brown MD, Schatzlein AG, Uchegbu IF. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers. Int J Pharm, 2001, 229: 1-21

〔7〕 Godbey WT, Wu KK, Mikos AG. Poly(ethylenimine) and its role in gene delivery. J Control Release, 1999 ,60:149-160



Study on the Transfection Efficiency of the New Cationic Polymer Transfection Reagent: Sofast

Yang Tian-Ci1 Chen Ming-Qiao2 Huang Ge-ling3

(1. Laboratory for Biochemistry and Molecular, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Blood Donor Center of Putian City, Putian 351100, China; 3. Xiamen Maternity and Children’s Hospital, Xiamen 361000, China )



Abstract: AIM: To study the transfection efficiency of the new cationic transfection reagent: Sofast. METHODS: DNA arrearage assay was firstly applied to determine the capacity of combination between transfection reagent Sofast and DNA. Then several different report genes (GFP gene , β-galactosidase gene and luciferase gene) were adopted to compare the transfection efficiency to HEK293 cells of Sofast and the toxicity with those of cationic liposome Lipofectamine 2000, cationic polymer Jet PEI and Superfect . RESULTS: In our study, DNA arrearage assay showed the strong combination between Sofast and DNA; Using GFP as report gene, we found that the highest transfection efficiency can be acquired from Sofast among the four transfection reagents, it is about 60%, moreover GFP expressed largely in single cell; Activiation luciferase detection suggested that when the weight ratio of Sofast to DNA was about 16, its transfection efficiency got over 109RLU/mg and this was higher than that of the other three. Furthermore, this efficiency is 1.6, 2.3 and 5 folds of the highest efficiency of Jet PEI, Superfect and Lipofetamine 2000, respectively. According toβ-galactosidase staining, we found that the positive cell transfection ratio of Sofast got over 95%. On the other hand, the cytotoxicity assay showed that over 83% cell livability could be achieved by Lipofectamine 2000, Jet PEI and Superfect , while 94.23% cell livability by Sofast. Specially, to HUV-EC cell line, Sofast could still maintain about 20% transfection efficiency, though that of all the other reagents available in market now was low. CONCLUSION: Sofast is a high efficiency but low cell toxicity transfection reagent.

Key words: Sofast; Transfection; Cytotoxicity; HEK293;Cationic Polymer





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作者简介：杨天赐（66-），男，副研究员，博士生

通信地址：厦门大学海滨东区30-103室 361005 email: [e-mail]