一山更比一山高：聚焦转染之Merck篇[选购宝典]

【字体：大中小】 时间：2005年08月05日 来源：生物通

编辑推荐：

生物通技术评测德国默克是世界上历史最悠久的化学制药公司之一。已有335年历史的默克公司于1998年收购了美国CN Bioscience集团(包括Calbiochem，Oncogene，Novabiochem和Novagen四大品牌)，CN Bioscience(现已改名为MERCK Bioscience)的四大品牌分别在生化、信号传导、蛋白质化学和分子生物学领域内均以创新而优质的产品著称。另外，默克生化小组（中国）还独家代理了以其优质文库等分子生物学产品著称的Stratagene产品在中国的业务。

转染技术包括了将DNA、RNA、蛋白等生物大分子传递到真核细胞内部，这在Merck旗下的玲琅满目的转染试剂中得到最好的体现，因为无论是DNA、RNA或者是蛋白转染，Merck总有一款专门设计的产品能满足你的需要――要知道Novagen和Stratagene可都是分子生物学产品中响当当的角色。花多难免眼乱，这么多试剂该如何选择，各自有什么特点呢，且看生物通为你一一点评。

蛋白转染试剂

转染在广义上的定义是指将动物的DNA或RNA，蛋白质以及大分子转送进入活体细胞中。很多时候，将DNA转进细胞也是为了让它表达，但是DNA转染存在一些问题，比如存在各种因素可能影响表达效果和表达产物的活性；表达时间长（24—72hr）；表达量难以控制；表达产物对细胞生长有毒时就无法区分其功能和毒性，DNA载体上的其他元件也可能会干扰细胞的功能，不适于表达较大的分子或者多亚基分子，DNA可能会整合到染色体组上等等——如果直接将完整的蛋白质转进去是不是更好呢？对于研究蛋白与蛋白之间的相互作用，蛋白的亚细胞定位，蛋白质周转（protein turnover，包括蛋白质合成和蛋白质降解以及相关的蛋白酶类等）、信号传导通路和细胞凋亡，以及转录因子介导的基因调控的研究，或者研究一个外源蛋白在哺乳细胞中的作用，最快速直接、有效的方法就是将蛋白直接转染到细胞中去，因此，蛋白质转染试剂就“应运而生”了。

蛋白质转染目前远远不如DNA或者RNA转染那么广泛，原因有很多，比如蛋白质纯化比DNA纯化困难，转染蛋白的持续性和稳定性等等，但这种方法却实实在在的提供给研究人员一个非常有用的工具，可以直接快速而精确地研究蛋白质的功能。我们生物通的编者相信，在不远的将来蛋白质转染一定会大放异彩的。所以，即使你一时用不上蛋白转染，也应该关注这种技术，因为结合自己的实验你很可能会设计很有创意的应用。比如，药物研发中的蛋白质给药就比基因治疗安全，没有变种的危险；比如研究某个抑制模型时，可以用瞬时补偿基因产物来验证基因的功能；比如可否将HIV抗体直接导入隐藏了的感染T细胞呢？你有更多的创意吗？只要你敢想，就会发现蛋白质转染是非常有用的工具！

蛋白“护花使者” ProteoJuice（Novagen）
Novagen的ProteoJuice Protein Transfection Reagent就是一种专门为多肽或者蛋白转染而设计的试剂，可以与蛋白形成非共价键连接，保护蛋白在进入哺乳动物细胞时不被破坏结构，是一种理想的蛋白转染试剂。并且，ProteoJuice 在保持高转染率和低毒性的条件下，可以适用于多种细胞（例如A549 COS-7 HepG2 MCF-7 PC12 BHK-21 CV-1 HEK-293 Neuro2A Raw 264.7 CHO-K1 HeLa L6 NIH-3T3等）和各种大小的蛋白，目前已知的，从11kD大小的组蛋白和小肽，到150kD的抗体大蛋白，甚至是蛋白多聚体，比如β-galactosidase tetramer(465kD)，ProteoJuice都已经有了成功的范例。

操作方法：蛋白质转染复杂吗？只不过比DNA转染稍微复杂一点点：培养细胞至80-90%汇片，用无血清培养基稀释目的蛋白，再加入等比的ProteoJuice，振荡混匀温育20min。用无血清培养基洗细胞3—4次，加入转染试剂—蛋白混合物温育培养若干小时。通常3—4小时蛋白已经转入细胞并可以检测，较大的蛋白如抗体可能需要5小时。如果需要可以在温育3小时后补加完全培养基。检测前用无血清培养基或者PBS洗涤细胞以除去未转染的蛋白，防止影响结果分析，然后就可以分析结果了。

注意事项当然是需要考究蛋白质的浓度和纯度（幸好越来越多的蛋白样本制备工具使得蛋白样本处理变得简单高效了，比如Merck自己的蛋白样品制备系列就有很多选择，现在还有75折特价呢），转染过程中要避免血清的干扰，最后检测前要彻底洗掉残留的蛋白。至于效果如何？厂家提供的图片相当漂亮。

价格和用量：好东西不便宜。蛋白和转染试剂的用量推荐是1:1，一次24孔板1.25微升就够了。可以做100次（24孔板）的转染试剂（0.125毫升）价格要4000多点呢。实验结果毕竟更重要。记得是4度保存的。

“大肚能容天下”的BioTrek（Stratagene）
Stratagene也有BioTrek™ Protein Delivery Reagent，这种适合蛋白、小肽以及大分子转染、用途广泛的转染试剂是一种脂质体转染试剂，也能够和蛋白质形成非共价偶联，并被细胞膜负电荷吸引，经过内吞等几种不同原理进入细胞膜，进入后即发生解离，释放完整的蛋白到细胞质。相对而言，BioTrek转染效率较高（50%—95%），已知适用成功的细胞系包括293 B16-F0 BHK-21 CHO-K1 COS-1 COS-7 CV-1 HeLa HeLa-S3 HepG2 Jurkat K562 Ki-Ras 267 β1 MDCK NIH 3T3 P19等。BioTrek是24个独立包装，操作简便（仅需3—4小时），提高了研究工作效率，大大的节约了时间。

操作方法：这个比上面那个更好用一些。培养细胞到汇合度为50—60%，用PBS或者HBS稀释样品蛋白，稀释的样品直接加入独立包装的BioTrek管中（转染试剂是冻干在管壁上的，便于运输保存和使用）溶解混匀，温育5分钟，振荡3—5秒，加入无血清培养基混匀。去掉细胞中的培养基（可用无血清培养基洗一次）并换入无血清培养基，加入转染试剂盒和蛋白质混合物。保温孵育4小时，通常多数细胞已经可以检测到目的蛋白进入细胞，当然可以温育更长的时间，不过4小时以上最好加一倍体积含20%血清的培养基（终浓度10%），如果24小时以上就要换培养基了。这个试剂盒还同时提供2种不同的对照蛋白，有FITC标记IgG和beta半乳糖苷酶蛋白作为对照，对于新手再好不过了。记得检测前要彻底洗掉未转染的蛋白以免影响结果。

价格和用量： BioTrek™ Protein Delivery Reagent（24次独立包装，6孔板，如果是24孔板同一个样品还可以分装4孔）价格多少？要屏住呼吸，再看——要5700多！价格绝对是“贵妃”级——贵到飞起。但是一分钱一分货，24次独立冻干包装非常方便运输和保存和使用，能保证转染效果，而且同时提供的2种不同的对照蛋白（一种荧光，一种颜色）非常好用，对实验的成功或者问题解决非常有帮助——细微之处见真功，绝对是Stratagene的风范（当然，价格贵也是Stratagene的特色:( 为什么好东西总要那么贵呢!幸好不时有6折大促可以偶尔安慰一下我们容易受伤的心）。独立包装还有个好处，便于几个实验室间分装降低成本。冻干粉也是要负20度保存的哦！

DNA转染

Novagen的GeneJuice Transfection Reagent
阳离子脂质体有一定的细胞毒性作用，通常要求较高的铺板密度，而且有研究表明脂质体可能干扰细胞功能而造成一些假相。在不懈追求更好的转染替代产品的过程中，多胺作为一种毒性低、带多个正价基团可以更好吸附核酸的脂质体替代物而越来越受重视。GeneJuice是一种小分子多胺配方的新型转染试剂，还添加特殊的无毒蛋白质，帮助获得更高的转染效率。经过3年多的用户验证，GeneJuice适用的细胞多达130多种。使用方便，不需更换培养基与洗涤细胞，低毒，高效的GeneJuice是一个非常好的选择。

特点：低毒，高效。转染前后也都不需要更换培养基，转染后也不用去除转染复合物，有血清也不怕，据说有血清时的转染效率可能还会更高些。已经有130多种细胞的成功转染报告，包括一些难转染或者原代细胞，http://www.emdbiosciences.com/product/70967这里同样有这些细胞的列表，虽然不够详细，在选择前还是很值得参考的。GeneJuice主攻项目是DNA转染。除此之外GeneJuice也可用于转染大分子DNA、小分子Oligos DNA和 RNA。对于siRNA转染我们还是建议选择专项优化的产品。

用量和价格：作为刚刚开始在国内推广的GeneJuice，不久前在生物通网站上派送过一轮免费试用装，用户的反响很不错。现在虽然没有6折，还可以继续7折促销到9月底，以7折后1毫升RMB2600的价格来看还是满经济的，因为以每次6孔板实验为例，一般1ugDNA建议用3ul转染试剂就足够了， 1毫升足够300多次转染（6孔板）——如果实验中总是转固定的那几种细胞株，还可以优化条件节约试剂——对付有些细胞高手每次用2ul也足够对付了——这就是宣传资料说最多可转染500次的出处吧。

操作流程：好像现在好用的转染试剂的操作都已经简化到差不多最简了，所以看起来都差不多， GeneJuice也不例外：GeneJuice™——简便的5步操作（以贴壁细胞转染为例）

1. 接种细胞——转染前1天用完全生长培养基在35-mm培养盘接种培养约1–3 × 10⁵ 个细胞，37℃(5% CO2) 过夜。转染前细胞覆盖率应该达到50–80%。
2. 转染试剂预处理——按每35-mm培养盘需要量计：在无菌管中加入100 µl无血清培养基，滴加3 µl GeneJuice转染试剂，彻底涡旋混匀。室温孵育5分钟
3. 制备转染试剂/DNA混合物——每35-mm培养盘需要将1 µg DNA加入GeneJuice转染试剂/无血清培养基混合物，温和吸打混匀。（注意：每ug DNA需要2–6 µl GeneJuice转染试剂）
4. 转染细胞——将GeneJuice/DNA混合物全部滴加到培养在完全培养基中的细胞上，前后轻摇一下培养盘以确保均匀分布，但避免形成涡流而导致中间浓度过高
5. 细胞孵育——37℃孵育转染细胞24–72 h小时 (5% CO2)。收集细胞用于分析

注意事项：这个转染操作中以及细胞孵育过程中均不要求更换培养基或者洗涤细胞，因此是目前使用最为简便的转染试剂之一。GeneJuice是4度保存的——即使有乙醇做溶剂，也千万别“万一不小心放到-20度”了，记得盖紧盖子（避免氧化）。保证待转染细胞的生长旺盛是转染成功的重要因素，多数情况下铺板密度50%—80%（1.0–2.0 × 10⁶），个别情况根据需要优化吧。稀释转染试剂也是要求用无血清培养基的，推荐的转染试剂和DNA的比例也是黄金标准的3:1，逐滴加入培养皿中时尽量要均匀，前后晃晃就好了，不要旋转摇形成涡流，以免中间浓度过高。通常情况下GeneJuice毒性很低，万一个别细胞对这个成分敏感的话可以适当提高铺板密度。抗生素和添加剂一般也不建议使用，等转染后1—2天抗性基因表达后再加选择压力。

    GeneJuice还有个同名兄弟，Insect GeneJuice，顾名思义适合昆虫细胞转染。不过新出的Insect GeneJuice其实是低毒配方的脂质体类转染试剂而非多胺配方，之所以同名，也许是因为Insect GeneJuice有着和GeneJuice同样简便好用的优点。昆虫细胞表达兼有高产和真核表达的很多优势，但市面上可供选择的昆虫细胞转染专用试剂很有限，多年来操作麻烦的Cellfectin继续一支独秀。新出的Insect GeneJuice可能会是值得留意的新亮点——由于在转染前后都无需更换培养基或者洗细胞，兼容有血清培养（只要配的时候没有血清就可以），也很适合大规模蛋白表达时的转染或者杆状病毒共转染（重组），操作比Cellfectin方便很多！可惜就是3500/1ml的价格也比Cellfectin（2500多）贵好多，每次用量还比人家多！图方便还是图便宜，就看各人的侃价能力和承受能力了。不过我觉得做昆虫的同志还是很应该留意一下Insect GeneJuice的，毕竟有了方便好用的新产品，谁还愿意回到从前？

Stratagen公司 GeneJammer Transfection Reagent

    另一种多胺专利配方，适用于包括原代细胞在内的多种细胞（悬浮细胞或贴壁细胞）的瞬时转染或者稳定转染。正是由于毒性极低的多胺配方，减少了转染过程中对细胞膜的伤害，而且也避免了脂质体对细胞功能产生的潜在干扰，因此GeneJammer可以保持高转染效率，除此之外，GeneJammer还有一个最吸引人的地方，就是无论有或无血清、抗生素、生长因子或者其它添加物，GeneJammer都一样适用。许多好用的转染试剂都可以在有血清的条件下转染（甚至转染效率更高），但是要求在培养待转染细胞过程中避免添加青霉素一类的抗生素，以免转染时细胞毒性太高。那不加抗生素又害怕污染怎么办呢，毒性超低的GeneJammer就是答案啦。就从这一点你可以想象GeneJammer毒性超低的意义啦。而且多胺类转染试剂对某些细胞系效果特别好，比如脐带血管上皮细胞。

特点：低毒高效，避免了脂质体类物质对细胞的毒性或者对细胞功能的干扰，转染后无需更换培养基或者去除转染复合物。通常，转染前后没有“禁用抗生素或者添加剂”之类的限制。单一的配方，不会沉淀分层，用前无需混匀。

适用的细胞系范围：超过100多种细胞株，同样包括原代细胞和部分难转染的细胞系，相当宽的适用范围。想检查你的细胞株是否属于这100多种成功案例之一？看看Stratagene网上的介绍就好啦。

适用的核酸大小：DNA，包括大到12kb的质粒，效果都一样出色。这点很重要，因为通常较大质粒转染效率会降低。SiRNA？RNA？蛋白质转染？留给其他专业的同伴吧！

操作流程：虽说大同小异，GeneJammer还是有一点不同，培养细胞至60%—80%汇片，用无血清培养基稀释转染试剂（10min），记得不要让Tips“碰壁”也不要涡旋振荡，轻轻弹弹混匀就好啦（10min）。加转染试剂前要先去掉培养皿中的培养基，换成900ul含血清培养基，滴加转染试剂，温育3小时后再补加900ul培养基（如果是悬浮细胞就可以省掉这些麻烦了），温育1—3天后看结果或者继续筛选稳定表达株。这个操作要比前面介绍的麻烦一点，原因可能是让细胞接触更高浓度的转染试剂DNA复合物有助于提高转染效率？其实稀释转染试剂和加DNA的时候也是不能有血清抗生素等添加剂的。但是培养细胞没有这个限制，还是有自己的优势的。

注意事项：这个也是4度保存的，而且6孔板建议使用6ul和2ugDNA，用量比较多一些。而且1ml价格高达3900多（贵...），一边是价格，一边是使用方便，唉，“站在天平的两端，一样的为难……”如果不是碰上特殊的细胞系和特殊需要（比如新手，要用抗生素或者添加剂什么的），还是等大特价吧。

其他类型的DNA转染产品
    一个人多年形成的习惯，是很难改变的。习惯的力量有多大？在脂质体、多胺类转染试剂大行其道的今天，古董级的磷酸钙和DEAE瞬时转染产品依然在Stratagene买得到，因为有人就是喜欢。当年Clontech推出了创新的SMART技术的建库试剂盒后要取消原来的马拉松建库试剂盒（从这个名字就可以想象这个Kit的操作有多么艰苦漫长），竟然遭到很多老用户的强烈反对，最后继续保留到今天。Stratagene的MBS Mammalian Transfection Kit等几个曾经经典的产品也是同样。而且经过一些改良，这2个曾经“技术要求很高的”的方法也变得不那么复杂了了，转染效率也提高到十分之一以上。为什么有人始终不离不弃？是因为特别适合某些细胞株？还是因为特别适合某些特殊目的的研究？在一切只求“更高更快更简便”出结果的今天，不求甚解如我，暂时没有考究出来，如果有人知道的希望可以email到生物通告诉我，我可以及时更正以免祸害后来人吧。

脂质体转染大行其道，令Lipofection这个词家喻户晓，脂质体当然有自己独到之处，无怪乎每家都会有自己的脂质体的转染试剂。Stratagene的LipoTAXI Transfection Reagent名字真是形象有趣。LipoTAXI在最佳转染效率与细胞毒性之间找到了一个最佳平衡点，它可以转染30多种贴壁培养或者悬浮培养的哺乳动物细胞。经过一些实验人员的使用验证，LipoTAXI是一种综合评价较高的转染试剂。

siRNA转染试剂

双链RNA经Dicer酶切后会形成21—25nt的双链小RNA，这些称为siRNA的小东西一旦与mRNA中的同源序列互补结合就会介导mRNA降解，引发“基因沉默”，双链RNA这种对基因表达的阻断作用就被称为RNA干扰（RNAi）。由于可以简单方便地“敲除”某个基因的表达，RNAi技术已经成为研究基因功能的最热门的有力工具。RNAi的实验方法有很多（参考生物通新技术专栏的RNAi专辑），siRNA转染是最直接有效的一种——除了选择合适的siRNA，转染这一步是十分关键的——没有高效的转染，就无法得到准确的实验结果，但是转染质粒DNA的最佳试剂往往不太适合siRNA的转染（DNA和siRNA的大小差得太远了，参考RNAi转染试剂龙虎榜——为你的RNAi实验选择合适的转染试剂），因此，各厂家纷纷推出了自己的RNAi转染试剂。Novagen与Stratagene也都有专门为siRNA准备的转染试剂。

“眼明手快” RiboJuice（Novagen）
Novagen公司以原核蛋白表达的“金字招牌”pET系列载体享誉盛名，在细胞转染方面虽然Novagen产品不多，却少而精，在siRNA转染试剂方面就有RiboJuice™ siRNA Transfection Reagent。RiboJuice™ siRNA Transfection Reagent是一种高效转染，低毒设计的siRNA转染试剂。经典的特点就是操作简便，即不需要更换培养基，也不必清洗细胞，为操作节约了大量的时间，因此也就提高了转染效率，增强了转染效果。另外RiboJuice适用的细胞也比较多，包括A549, BHK，CHO，COS-7，HEK293，HeLa，HepG2，HONE-1, L428, L591, L6, MCF-7, Neuro-2A, NIH 3T3, Primary or first passage rat HSC, Primary aortic smooth muscle, Primary keratinocytes等等。除此之外，RiboJuice还可以和DNA转染试剂一起实现siRNA和DNA质粒的共转染，高效沉默外源基因（连同Novagen另一产品GeneJuice）。

操作流程：培养细胞到50— 80%汇片，无血清培养基稀释转染试剂，5分钟后加siRNA混匀，再等5—15分钟就可以直接加入细胞中，等着检查结果了。如果是共转染则将GeneJuice和质粒混合，以及siRNA和RiboJuice的混合物共同加入培养皿中就好了。

价格和用量：24孔板计算每次用2ul转染试剂，siRNA建议终浓度在0.1nM—25nM，这个很大程度也取决于这个siRNA的设计的。6孔板建议用6ul转染试剂。价值2590元的0.3ml包装的RiboJuice大约可做150次24孔转染，或者50次6孔板。你觉得贵吗？

“因小不失大”的GeneEraser（Strategene）
Strategene公司虽然以高保真PCR酶和文库构建方面的产品誉满业内，但由于其独创性和高品质，Stratagene在其它方面做的也毫无逊色。就像在研究基因功能与基因治疗的基因沉默方法这一块，Stratagene为研究者贡献了多种新型的研究工具。其中就有siRNA转染试剂：GeneEraser™ siRNA Transfection Reagent。

GeneEraser™ siRNA Transfection Reagent是一种确确实实为siRNA转染准备的转染试剂。之所以这么说，是因为GeneEraser可以高效直接的将siRNA运送到细胞质中和mRNA结合，从而导致mRNA降解，完成瞬时转染或稳定转染。并且更重要的是，这一试剂只需要很低浓度（1-10nM）的siRNA就可以使特定的基因表达沉默，这对对于RNAi实验人员来说无疑是十分吸引的。

GeneEraser适用于包括CHO-K1，NIH/3T3，HT-29，A549，293，Hela，Monkey Kidney在内的多种细胞，而且在这些细胞系中转染效率很高，比如在Hela细胞中的转染效率可高达95%—100%。这也是GeneEraser的在siRNA转染试剂当中倍受好评的一个重要原因。除此之外，相比较于很多阳离子脂质体转染试剂，GeneEraser低毒性可以显著减少对细胞的伤害。GeneEraaser还可以在有血清的培养基中转染，无需更换培养基，这样就使转染操作简便了很多。

操作流程：用无血清培养基稀释GeneEraser，室温孵育5—15分钟，加入siRNA再室温孵育5—15分钟；将转染复合物加入刚刚更换新鲜培养基(含血清)的细胞中，继续培养直到检测。

用量和价格： GeneEraser也是“贵妃”级的。0.4ml转染试剂现在价格高达3500，以24孔板计算只能用100—200次，要是6孔板，只能用50—70次。所谓一分钱一份货，指的就是这种东西吧。（生物通编辑小组原创，谢绝转摘）