分子生物学篇之质粒DNA纯化[选购宝典]

【字体: 时间:2008年03月12日 来源:生物通

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  质粒纯化试剂盒已经成为了许多年轻研究人员制备质粒的首选,但是随着对质粒纯化的更高要求,能够从更大培养物体积和片段大小,在更短的时间内制备出更干净的DNA是一种必然的趋势,这也是未来质粒纯化试剂盒的发展方向。

2007年刚过,各种年终汇总琳琅满目,生物通网站也将于未来一个多月里大摆生物技术饕餮盛宴,为读者带来前沿技术和最新信息的思维享受和满足--每日密集精选各厂家及经销商过去一年在中国大陆地区着力推广的重点产品文章或者最新上市的新产品新技术文章,将2007年当中生物通网站倍受瞩目的产品和技术一一呈递,打造精彩纷呈的生物技术产品“视觉盛宴”。

 

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质粒DNA纯化篇

质粒纯化试剂盒已经成为了许多年轻研究人员制备质粒的首选,但是随着对质粒纯化的更高要求,能够从更大培养物体积和片段大小,在更短的时间内制备出更干净的DNA是一种必然的趋势,这也是未来质粒纯化试剂盒的发展方向。

硅膜(Silica membranes)和离子交换树脂(exchange resins)已经取代氯化铯成为了质粒DNA纯化的主宰。目前市面上的各种质粒纯化试剂盒能完成各种快速制备纯净质粒的需要,已经不需要再痛苦地从氯化铯梯度中提取包含有溴化乙锭的DNA了。

另一方面,虽然质粒纯化试剂盒已经成为了许多年轻研究人员制备质粒的首选,但是随着对质粒纯化的更高要求,能够从更大培养物体积和片段大小,在更短的时间内制备出更干净的DNA是一种必然的趋势,这也是未来质粒纯化试剂盒的发展方向。

在新推出来的一些试剂盒新品中,包含了从miniprep(0.5-5ml培养物)至gigaprep(5L培养物)的制备规格,提取过程可以大规模(96孔板)或者单个样品进行等方面的新产品优势。希望从中您能挑选到符合研究需要的产品和技术。

 

当高产遇到高速……

当研究从DNA测序转移到蛋白表达分析时,我们需要一个能够快速地分离数百微克高质量的质粒DNA的纯化方法来满足我们在真核细胞转染和体外表达实验的需要。Promega推出的PureYield™质粒中提系统是其中的佼佼者。

这一款试剂盒提供了一种快速、简便的技术:应用新开发的二氧化硅膜纯化柱技术,在30分钟内从大肠杆菌中提取出100-200ug高纯度的质粒DNA,使用真空装置可在30分钟内完成质粒DNA纯化。另一种可选得方案是从250ml的E.coli培养液中纯化出超过400ug的高拷贝质粒。与树脂法或其它的膜纯化柱相比,极大的减少了质粒的提取纯化时间。

传统的核酸提取方法最早即SDS碱裂解法:将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。在裂解过程中,细菌蛋白质破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被SDS包盖,当用钾离子取代纳离子时,这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后,就可从上清中回收复性的质粒DNA。从真核细胞中提取核酸可采用蛋白酶K和苯酚处理细胞裂解液。用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性,再用蛋白酶K消化细胞或组织,核酸通过有机溶剂苯酚抽提进行纯化。

这种经典的核酸提取方法能获得满足基本分子生物学的需要,但是由于这一过程中要使用有机溶剂,而这些有机溶剂有可能对实验后续过程以及实验人员造成不良影响,因此提取核酸DNA已经发展出了越来越多的新技术。

其中就包括二氧化硅膜纯化柱技术,这种技术能避免核酸提取过程中使用到有机溶剂,只需要利用二氧化硅来吸附核酸。主要步骤包括将样品利用含有异硫氰酸胍,Troton X-100的Tris-HCl-EDTA提取缓冲液处理后,加入二氧化硅悬浮液,室温下孵育,再经含有异硫氰酸胍的Tris-HCl缓冲液和70%乙醇以及丙酮分别洗涤,最后用TE洗脱,获取核酸。这样不仅避免了有机溶剂的抽提,而且由于异硫氰酸胍具有抑制RNase的作用,可以同时提取DNA和RNA。这一方法运用以来就有许多商品化的核酸提取试剂盒问世,而且开发成自动核酸分离提取系统,将二氧化硅制作成滤膜,更方便了核酸的分离提取。

PureYield™质粒中提系统就是这样一款试剂盒,其中的裂解清洗液和DNA结合纯化柱具有高透过率特性,避免了提取纯化中的高速离心步骤。PureYield™中提系统使用低速、吊篮离心法、真空负压法、或二者相结合的方法从大肠杆菌中提取纯化质粒DNA,在提取方法上提供了最大限度的便利。真空负压法快于低速离心法,但在生物通量(如培养体积或细胞数量)多的情况下,离心法能更有效的清除裂解物。而真空负压与低速离心相结合的方法在DNA结合阶段具有真空负压法的快速特性,而在裂解物清洗阶段具有低速离心法更有效清除裂解物的优点。在低生物量的样品中,这3种方法都能使您得到高质量的质粒DNA以及相似的产量。

而且这一系统整和了独特的内毒素清洗步骤,能够清除内毒素、蛋白和RNA污染,从而避免了这些污染干扰一些高敏感度实验的可能,可满足真核转染、体外转录与翻译等分子生物学实验的要求。整个系统装置简单,非重力纯化柱系统,纯化不需要高速离心和异丙酮沉淀,以快速、简便的方法提供高浓度、纯化的质粒DNA。
 

 

当大规模遇到超纯……

说到DNA纯化,自然免不了提到Qiagen公司,这家具有核酸纯化金字招牌的公司包含了广泛的质粒和基因组DNA、mRNA、总RNA纯化试剂盒,其中质粒提取试剂盒有QIAfilter Gigakit(10mg of DNA)到microR.E.A.L.Prep384 plasmid kit(1.5μg of DNA per well)等产品,包含了高级转染级、常规转染级、分子生物学级和测序级(具体请见选择适合自己的质粒提取试剂盒——Qiagen篇)。

这里要提到的是一款超纯质粒纯化系统:HiSpeed离子交换柱纯化系统,这个系统可以让你在收菌之后不用离心机即可在短短45分钟内纯化高达200μg的超纯质粒DNA,纯度相当于两次CsCl超离的纯度。

目前随着MiniPrep Spin一类的离心柱式的小规模质粒纯化系统的日渐推广,越来越多的同行们感受到质粒纯化的方便简单:只需要一台小型高速离心机,只需要不到30分钟,收菌,加入溶液1、2、3,离心,上清液上柱,离心洗涤,最后离心洗脱即可得到多达20μg的高纯度的质粒DNA。这种质粒适用于酶切、连接、测序、转化等常规分子生物学实验。如果希望制备超纯(>2 次 CsCl超离纯度,可用于转染、转基因、基因疫苗等实验)的质粒DNA特别是要大规模制备超纯质粒,就要用到特制的离子交换柱技术:收菌后加溶液1、2、3,离心取上清,上特制的离子交换柱,洗涤,重力洗脱,洗脱液经异丙醇沉淀、干燥后TE重新溶解,得到相当于两次CsCl超离纯度的质粒DNA。相比传统方法和两次CsCl超离,这种试剂盒的操作要简便快速得多了;但是相比MiniPrep Spin,由于制备样品量大,必须用到中型或大型高速离心机,加上最后洗脱液要经异丙醇沉淀(如果用乙醇沉淀则离心体积更大)、干燥、重溶解,还是显得比较麻烦和费时。

而HiSpeed超纯质粒纯化系统采用了QIAGEN最新的研究成果——QIAGEN离子交换树脂HS,保证更快速高效的在低盐条件下特异吸附质粒DNA,使得上清液过柱速度大大加快,柱载量也提高一倍,达200μgDNA。

主要过程就是收菌后分别加入溶液1、2、3,用一个针筒式的QIAfilter Cartridge直接过滤裂解液,这种滤器不但可以避免使用大型高速离心机,并节约时间,还可以彻底除去溶液中的SDS沉淀和离心时可能悬浮在上清液面的少量细胞碎片,避免堵塞纯化柱。

最重要的是QIAGEN革命性的全新设计——DNA沉淀滤器,其外形与用法都和普通的一次性滤器相似:只要将纯化柱洗脱的DNA溶液加入异丙醇后用提供的针筒滤过这种沉淀滤器,DNA即被吸附在滤器上,最后再用特制的注射器加500微升双蒸水或TE洗脱即可得到相当于两次CsCl超离纯度的质粒DNA溶液。无需高速离心机,无需异丙醇沉淀,无需干燥DNA沉淀,或重溶DNA,全程仅需45分钟,非常方便快捷,特别适合没有大型高速离心机的实验室。

 


当质粒抽提遇到阴离子交换……

Ivitrogen公司在质粒纯化试剂盒方面之前一直以S.N.A.P.系列和Concert系列的核酸纯化系列为主打产品,随着其技术的发展也逐渐推出了具有自己特色的质粒DNA纯化试剂盒,其中PureLink™系列利用的就是阴阳离子交换树脂,是为分离最高纯度的质粒DNA所设计的,能满足各种分离规模的要求的一款试剂盒。

阴离子交换是一种最常用的制备极高纯度DNA的技术,PureLink高纯试剂盒(PureLink™ HiPure Plasmid Purification)利用阴离子交换技术提供高度纯化的,转化级的质粒样品的提纯。这种由独特的更小粒子组成的树脂具有更加一致的孔径,提供更大产量及重现性。Spacer arm提供了更大的结合效率和独特的专利性离子交换部分提高了RNA与DNA分离效率。

其纯化率用具体的公示比较来表述就是:一次PureLink纯化纯度=两次氯化铯梯度纯化同样的质粒DNA纯度。而且PureLink操作流程简单,不需要额外的操作步骤来去除RNA,蛋白和内毒素,整个操作流程不超过2小时,而且可以获得足够纯净的DNA进行转染实验,也避免了酚、氯仿、氯化铯和溴化乙锭等有害物质。

这类试剂盒应用范围较广,可对小量样品及超量样品进行制备。通过这种方法提取的DNA纯度很高,且适用于要求最高纯度如转染敏感细胞系的所有应用。

 

当质粒抽提遇到超螺旋……

对于许多从事基因治疗或者高端DNA操作的研究人员来说,如何获得超螺旋质粒DNA是令人头疼的一件事,Amersham Biosciences公司(现属于GE)2006年推出的PlasmidSelect Xtra, PlasmidSelect Xtra Starter Kit 和PlasmidSelect Screening Kit系列试剂盒在这一方面发挥了专攻的优势,解决了这个难题。

质粒DNA(pDNA)又称基因疫苗,是结构简单的非病毒载体。基因疫苗又称为核酸疫苗(nucleic acid accine),是指将编码某种抗原的外源基因与a质粒DNA载体重组,构建出真核表达载体,通过肌肉注射等途径直接导入动物细胞后,能利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白,并诱导宿主细胞产生对该抗原的体液和细胞免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。

在基因治疗中使用质粒DNA为超螺旋结构,因为超螺旋的质粒DNA转染效率高,使用超螺旋的质粒DNA可以大大的减少用药剂量。

PlasmidSelect Xtra 可吸附>2 mg/ml 6125 碱基的超螺旋质粒DNA。The Plasmid Select Xtra 的纯化过程包括RNA的去除和缓冲液的交换,然后用PlasmidSelect Xtra选择性的吸附质粒DNA,最后用离子交换介质进行最终地纯化。这个过程具有可放大性,结果重复性好,适合快速对质粒DNA的定性定量和cGMP的生产。

这些新产品有力的补充了GE Healthcare现有的高质量纯化,分析和定量质粒DNA的技术平台,为基因治疗和DNA疫苗的生产提供可更有力的工具。

除了这些新产品外,GE也提供了基因组、总RNA和mRNA的提取试剂盒。比如说QuickPrep™MicromRNA纯化试剂盒可以从单个真核细胞里提取mRNA,而Nucleon™DNAextractionkits可以从血液或者细胞培养物、植物或者坚硬的组织样品中提取基因组DNA.
 

 

当质粒抽提遇到真空管……

化学巨人SIGMA-ALDRICH公司具有广泛的基因组和质粒DNA、mRNA、总RNA提取试剂盒生产线。大部分都以GenElute™品牌的名字出售,包括GenElute高效质粒大抽提试剂盒,中抽提试剂盒和小抽提试剂盒。

去年Sigma推出了一款能有助于更好,更快,更方便进行质粒DNA提取的产品:VM20真空歧管(vacuum manifold)。

在DNA提取过程中,一般实验室的操作主要是通过离心机完成,实际上还有另外一种利用带luer连接器的真空歧管(vacuum manifold)完成抽提的方法,其特点如下:

高通量:可同时操作20个样品
无限容量:双端口设计能让废料收集在歧管中或者转移到后备储存器中
新颖的设计:方便的设计有利于每管使用
方便性:用Endura-Luer活塞代替了plug
耐用性:具有化学抗性的聚丙烯制成的

总而言之,当在实验中需要利用许多column核酸或蛋白纯化系统的时候,VM20 Vacuum Manifold可以提高效率和提取质量。这种manifold能同时进行20个样品的提取,并且包含了一个方便column操作的设计。双真空连接端口便于废液的多配置收集——通过manifold body或者后备设施。
 

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