[新品推荐]揭秘:无需转染试剂的siRNA

【字体: 时间:2008年04月21日 来源:生物通

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    RNAi作为一种强大的研究工具广泛用于沉默或者降低靶基因和靶蛋白的表达,从而揭示这些被沉默分子在生物学通路和疾病发生中的重要功能。深入了解基因功能对于药物靶点的研发至关重要。

    RNAi实验成功与否,影响siRNA的基因沉默效率最最关键的2个因素,一是siRNA的设计;另一个就是siRNA的递送----对于体外培养细胞来说就是siRNA转染。看准RNAi技术的广阔市场前景而闯入RNAi试剂领域的各大科研用品供应商纷纷推出各具特色的siRNA转染试剂,比如可反向转染、无需提前培养细胞的转染试剂,可同时转染质粒DNA和siRNA的转染试剂,高效低毒可连续转染的多肽类转染试剂等等(详情可参考《ebiotech技术特刊:RNAi 5年回顾及技术宝典》详细介绍)......但是,转染的脂质体试剂始终会带来或多或少的细胞毒效应而导致部分细胞死亡,操作者转染技术的水平也多少影响转染效果,不同的细胞株可能适合不同的转染试剂,还有一些原代培养细胞、悬浮细胞、干细胞和神经元细胞的转染效率不高,等等,问题多多。要是siRNA能直接进入细胞,那该有多好!

    作为RNAi研究试剂领域的三大品牌之一,赛默飞世尔旗下的Dharmacon最新宣布RNA干扰技术领域取得突破性进展,成功开发出一种最简单的沉默基因的新工具----Thermo Scientific Dharmacon Accell siRNA,它是一种全新的siRNA,可不借助任何传统转染介质(比如转染试剂、病毒载体和电转等)而被直接吸收进入细胞。目前已完成对50多种常见细胞株的测试,Dharamcon Accell siRNA均能有效进入细胞并高效沉默靶基因。Accell siRNA首次克服了由于细胞转染问题所带来的基因沉默效率不佳的障碍。Dharmacon Accell siRNA只需要简单的和专用的培养基混合,然后添加到到培养细胞即可完成整个转染操作。这是目前最简单的一种操作,只需两步操作,既高效经济又方便省时,并且可以避免实验操作所导致的细胞毒性效应和传统siRNA转染方法所引发的“off-target”效应。

更经济,无需转染试剂

    这到底是一种怎样的siRNA呢?真正使用起来如何呢?生物通编辑从搜罗到的资料来看,Accell siRNA是一种经过化学修饰的siRNA,能够被细胞膜吸附进入细胞中,无需转染试剂或者病毒载体,无需电转,即可“被动运输”渗透进入培养细胞株中,比以往任何一种商品化的siRNA都更加简便和经济。

更专一:有效避免脱靶反应,结果更可靠

    早前多个研究结果表明,某些情况下,仅更换转染试剂就可减少或者避免包括非特异免疫应答在内的脱靶反应,可见某些情况下脂质体潜在诱发脱靶反应的可能。由于不需要转染试剂而直接被细胞吸收,Accell siRNA能有效避免因为转染试剂等因素而诱发的脱靶效应,SearchLight Array platform(Human Inflammatory Cytokine Array 1; Pierce product # 84619)芯片对9种炎症反应因子的监测实验结果也证实Accell siRNA不引发炎症反应等脱靶效应

    Accell siRNA优势不仅仅是可以省掉转染试剂。我们知道,Dharmacon在siRNA设计理念和siRNA修饰领域全球领先,Dharmacon的SMARTselection参数设计建立在该公司著名的siRNA设计8大原则,包括GC含量控制,3’端碱基偏向性,减少重复序列、特异位点的碱基偏好性等等,还新增加siRNA反义链上类miRNA序列的Seed Region,以及SNPs位点、高度冗余序列和高度同源序列、某些毒性或者干扰素motif的过滤,以减少非特异的脱靶反应加上Accell siRNA 3’端-UU 设计更加接近天然状态下的RNAi产物;令修饰后的Accell siRNA专一性更强,稳定性更强(数据见后)。

    Dharmacon专利的On-Target技术更是独步天下----通过双重修饰siRNA的正义链和反义链----阻止正义链其与RISC的结合,5'端磷酸化修饰有效促进反义链与RISC的结合,双重修饰减少脱靶效应90%以上,真正意义上排除基因沉默中的脱靶效应,有助于提高siRNA的特异性,降低假阳性,增加基因沉默实验可信度(详情可参考《ebiotech技术特刊:RNAi 5年回顾及技术宝典》详细介绍)----显然,今天,Dharmacon在siRNA修饰设计上取得更令人欣喜的成果。

    Dharmacon的Accell siRNA质量也非常可靠。每对Accell siRNA经过MALDI-TOF质谱检测及非变性PAGE胶检测。Accell siRNA可分别以单条siRNA或者同基因多位点siRNA混合物pool的形式提供,保证有效沉默基因表达70%以上,方便使用。

更灵活: 可多次重复操作延长基因沉默效果 多基因沉默

    由于不用有细胞毒性的脂质体,也不用电击损伤细胞膜,Accell siRNA对细胞活力的影响非常微小,几乎可以忽略(见后图)。对于需要较长时间维持目标基因沉默的实验人员来说,可以多次重复加入培养基中,非常简单地延长目标基因沉默的效果,而不需要克隆载体的麻烦,也不会显著影响细胞活力。实验表明,每次更换培养基时都加入Accell siRNA,经过19天(传5代)后细胞活力80%的情况下依然保持70%以上的基因沉默效果。

    无需转染试剂的Accell siRNA在使用方便的同时,应用也更加灵活。你可以同时做多个基因的沉默,比如可以对已稳定表达siRNA表达载体的细胞株进行其他基因的瞬时沉默,或者多基因同时/分时沉默以更好研究基因之间的相互关系。只要敢想,Accell siRNA可以实现更多可能!省下自己设计siRNA的时间吧,这里更值得你花时间去动脑筋!

更简洁:无需摸索转染条件

    由于常规脂质体转染试剂的微量细胞毒性会影响转染细胞生长,转染时需要摸索适当的细胞生长密度以优化转染效果,这对于Accell siRNA就可以简化掉了,RNAi实验变得更加轻松简便。只要将Accell siRNA加入特定的培养基中,共同培养细胞,就可以等着检测结果了......

Broad windows of optimization provide experimental flexibility and high confidence results. MK2-U2OS cells were treated with 0.1, 0.5, and 1 μM Accell Cyclophiln B Control siRNA across three cell densities and assayed at 72 hours post-transfection.


更方便:适用于各种类型细胞

    Accell siRNA不需要转染试剂,是被细胞膜“被动运输”到细胞内,和细胞类型无关,理论上这种siRNA可适用于各种细胞,也不需要根据细胞类型修改操作方法,目前经过Dharmacon已经完成验证的50多种细胞中包括人类细胞,大鼠和小鼠细胞,甚至一些传统“难以转染”的细胞株,Accell siRNA都可以成功沉默目标基因表达。参考下表。

Human Suspension Cells Jurkat • THP-1 • IM-9
Human Differentiated Stem Cells Osteoblasts and adipocytes derived from hMSC
Human, Mouse, and Rat Primary Cells HUVEC • HUASMC • hMSC • PBMC • Primary human astrocytes • Primary human T cells • Primary human keratinocytes • Primary mouse hepatocytes • Primary rat cortical neurons • Primary rat striatum neurons
Other Mouse and Rat Cells 3T3 NIH • ES-D3 • 3T3 L1 • Rat2 • C2C12 • H9c2 • PC-12
Human Adherent Cells SH-SY5Y • IMR32 • LAN5 • A-375 • HeLa • HeLa S3 • LNCap• MCF-10A • 293T • MCF-7 • SK-BR3 • OVCAR-3 • Huh7 • GTM-3 • DU145 • HT1080 • DLD-1 • HepG2 • U2OS • HEK293 • U87MG • MIA PaCa-2 • NCI/ADR-RES


更稳定:Accell siRNA超强稳定性

    Accell siRNA相当稳定,实际上,厂家对4种不同保存形式(冻干,1x siRNA buffer, RNAse-free水, PBS),分别保存于5种不同温度(-80°C,-20°C,4°C,室温,37°C)的Accell siRNA,每3个月取样,分别在3个不同的工作浓度下对Accell siRNA基因沉默效率以及对细胞活性的影响进行检测,结果表明Accell siRNA稳定性相当理想,在9个月的时间内,这些条件都没有明显影响Accell siRNA活性核酸保存的常识是冻干保存优于缓冲液保存,缓冲液又比纯水好。我们仅取溶解在RNAse-free水中保存的Accell siRNA结果来看也已经很理想,即使在37度水中保存9个月依然可以得到70%的沉默效率。其他还用说吗?

Accell siRNA retains functionality following storage at a variety of conditions. Accell siRNA targeting human GAPD and Accell Non-targeting control siRNA (NTC) were stored at 1 mM concentration in RNAse-free water (10 μM data not shown)

    由于Accell siRNA最终需要混合到培养基中,实验结果表明,加入培养基后,4°C条件Accell siRNA下可至少稳定31天以上。

Accell delivery mix retains silencing performance for up to 31 days. Accell siRNA targeting Cyclophilin B and Accell Non-targeting control siRNA (NTC) were diluted to 1 μM in Accell delivery media. Data were normalized to untreated (UT). This delivery mix was stored at 4°C and tested for silencing performance at fi ve time intervals to assess retention of functionality.

操作更方便:混合培养就OK

    Accell siRNA t具体操作也很简单,只有一点不能算完美----Accell siRNA需要配合专用培养基,可这培养基是无血清的

    按照常规接种细胞和收获细胞,第二天按照常规方法收集细胞,去掉原有培养基,将Accell siRNA混合到专用培养基里,得到终浓度1um的Accell siRNA培养基混合液,加入细胞中培养48-72小时即可检测目标基因表达的变化。从前面的例子可以看到,虽然100nM终浓度siRNA也能得到理想的70%以上的基因沉默效果,不过较高浓度的500nM,1um的终浓度效果更佳。由于没有转染试剂帮忙,Accell siRNA要靠自己的本事穿越细胞膜,穿越效率相对低些,因而工作浓度高些效果更好。因为不必担心转染试剂的细胞毒性捣乱,即使较高Accell siRNA浓度也不至于引发非特异反应,厂家推荐起始siRNA浓度为1uM,比使用常规转染试剂时siRNA浓度(100nM)要高。    ----Accell siRNA在多种细胞密度下都能取得相当好的结果,由于不必考虑转染试剂优化,因此这个过程只需根据细胞株生长的情况优化细胞密度,从前面第一个图可以看到,不同细胞密度对结果影响也很小,换言之,很方便。细胞培养过程中使用的抗生素也不影响Accell siRNA的工作。

    一切都很方便。但是就是那么一点不完美:专用培养基为无血清培养基,虽然可以添加终浓度1-2%的血清,但是据说会影响Accell siRNA进入细胞的效率。至少培养48小时后再更换原来的培养基。Accell siRNA虽然可以高效渗透进入细胞,但毕竟不是自由进出细胞,大概是由于没有转染试剂帮忙,Accell siRNA实际上是在培养过程中慢慢渗透进入细胞的。换言之,细胞要在无血清或者低血清的条件下至少培养48小时才能换原来的培养基,这对于那些对血清非常敏感的细胞来说可不算好消息。厂家并不推荐配合使用其他培养基,但也没有禁止。想尝试需要自己探索了。但由于Accell siRNA需要在培养基中和细胞进行48-72小时的密切接触,而专用培养基混合Accell siRNA后可在4度稳定31天以上,可能比较有帮助吧?

    目前已经实验证实适用的细胞株已有50多种(见前表),要是你正好用这些细胞,那可别错过Accell!相信厂家会不断更新扩大这个细胞队伍的。

结论

    Dharmacon的Accell siRNA是目前唯一一种不凭借任何转染介质即可高效渗透进入细胞的siRNA分子。Dharmacon Accell siRNA和SMARTvector shRNA相结合,将是目前在生物化学和药物研究中最有效的基因沉默工具之一,研究者可以借此大大加快探索世界的研究步伐。(生物通 吴青)

QIAGEN转染大挑战,赶快来参加吧。

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