更快更高更强:QIAGEN Fast系列之全基因组扩增[选购宝典]

基因组分析的首要条件是获得足够的基因组DNA。当样品来源有限，利用基因组扩增技术就可以将原来原本不够DNA量而无法进行的实验继续进行下去。QIAGEN REPLI-g UltraFast采用多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)技术，克服传统PCR类方法出现的非特异扩增和扩增偏向性，是真正意义全基因组扩增方法。

    基因组研究对样品基因组DNA的质量和数量的要求是比较高的。但是，有时候样品的量是有限的，能得到的gDNA也是有限的----有的时候可能是极为珍贵的样品，比如来自某种珍稀物种；有的时候可能是样品来源有限，比如最安全的无创产前基因诊断中需要抽取产妇外周血中筛选出胎儿核型细胞（进入母体血液的胎儿细胞量非常少，又不能抽产妇太多血）；有的时候，根本就只有痕量的样品，比如用激光捕获显微切割(LCM)技术从组织冰冻切片中摘取的癌细胞，法医物证上微小的血迹点或者组织碎片，或者是显微镜下才可见的微小寄生生物......要对这类样品进行后继基因组分析研究时，必需要扩增样品基因组，否则无法继续实验。

    早前流行的PEP法和DOP-PCR法都是基于PCR的全基因组扩增方法,不可避免会产生非特异性的扩增产物,甚至出现不完全位点覆盖率或者位点或等位片段的缺失（扩增偏向性高达4-6次方），或者得到大量小于1kb的产物而无法用于后继基因组分析。这些都会对基因组分析的结果造成严重的影响。一种比较新的全基因扩增技术:多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)，能够提供高度均一完整的全基因组序列扩增，更低的位点扩增误差，是一种真正意义的全基因组扩增方法。最佳条件下MDA可以从不到10个人源细胞中扩增其基因组序列。

    号称基因组复印机的Qiagen REPLI-g 正是基于多重置换扩增技术，可对有限的样品进行快速、均匀、无偏向性的恒温全基因组扩增（isothermal genome amplification），从而获得更多遗传信息。扩增产物长度从2kb--100kb，平均在10kb以上。20ul反应体系通常可以得到7-10ugDNA，这个当然还要视乎样本基因组DNA的质量而异。REPLI-g 有2种Kit，一个是原来号称基因组复印机的普通版本，这个扩增的时间需要10-16小时，得到10ug产物；可是一万年太久，只争朝夕，现在连朝夕也嫌太久，实验要争分夺秒，你就需要REPLI-g  UltraFast Mini Kit----

    既然是微量样品，通常就要省略常规提取基因组DNA方法以避免样品损失----样品裂解后加入变性试剂令基因组变性，冰浴10分钟后再加入中和试剂中和，然后加入特有的REPLI-g UltraFast DNA Polymerase，在30度下保温1-1.5小时，即可有效且均匀、无偏向性地对目标基因组进行扩增。这个特别的DNA聚合酶的扩增长度可达到100kb而不从模板上脱落，因而能得到更完整的基因组扩增产物，更值得一提的是这个特别的DNA聚合酶还带有3'-5'端外切核酸酶的校读功能，能自行切除错配碱基，从而可以继续高保真地扩增基因组序列。由于这个DNA聚合酶带有外切酶校读活性，为防止其降解引物，这个试剂盒配套的引物特别设计增加了防外切酶修饰。引物为随机引物，可以均匀覆盖全部模板位点，保证扩增产品的位点均匀性，即便是靠近端粒的区段，也可以有效扩增。

    这个试剂盒起始模板量要求10ng以上，大致相当于0.5ul血或者300个细胞左右。虽然还没达到10个细胞扩增下限，但是也很不错了，毕竟越逼近极限条件就越需要大量时间反复实验摸索条件和丰富的实验技巧。这一个试剂盒是大名鼎鼎的“基因组复印机”REPLI-g的超快速版本，不单结果更好，速度更快，而且不需要复杂技巧，操作极为简单方便。通常一个反应(20ul)经过30°C保温1小时后可以得到7ug基因组扩增产物，1.5小时可以得到10ug左右产物；如果赶时间，反应45分钟得到的产物也足够后继许多基因组分析实验用了。扩增产物可用于SNP和STR genotyping，RFLP，Southern blot，比较基因组杂交（CGH），PCR或者定量PCR，芯片分析等等后继实验。试剂盒价格2260元/25次反应，每次成本90元左右。很值得推荐。（生物通编辑部）