生物通曾经开专栏讨论过体外表达产品，介绍了体外表达的原理，技术要点以及应用前景，同时对几家体外表达产品(如Roche, Promega)也做了简单介绍。QIAGEN作为原核表达的主要供货商，近年来在体外表达产品开发方面也倾注了大量心血。从其体外表达产品的名字就可以窥见一斑—EasyXpress system，意思就是以最快的速度让你获得你需要的蛋白。QIAGEN原核体外系统源自大肠杆菌细胞裂解物，而真核体外表达系统则利用—昆虫细胞（草地夜蛾）的细胞裂解物。

    任何一种蛋白的表达都是从模板制备开始的，EasyXpress Linear Template Kit Plus通过两步法PCR制备线性DNA模板用于体外翻译，获得的模板可用于任何一种QIAGEN体外表达产品进行后续蛋白表达。EasyXpress Linear Template Kit Plus采用特殊设计的引物，DNA编码序列得到扩增，同时也加入了利于在体外系统中进行转录和翻译的调节因子。正向接头引物序列中含有特殊设计的5' 非翻译区 (UTRs)，可以减少翻译起始区域形成二级结构的机率，这是引起蛋白低表达的最普遍的原因之一。可以非常灵活的在N或C端加入His标签或Strep-tag II标签，方便进行两步纯化，获得超纯蛋白（纯度大于98%）。该试剂盒可以进行20次两步法PCR反应, 每次制备获得的模板量足够进行4次蛋白体外表达。

    EasyXpress E.coli Kits对于模板的要求非常灵活，适合的DNA模板只要含有T7启动子就行，可以是环形质粒或线形DNA（如PCR产物）。EasyXpress E.coli Kits按照产量可以分为小量（Mini或Maxi Kit）和大量（Mega或NMR Kit）表达试剂盒。小量表达试剂盒主要用于表达模板筛选（当然，如果恰好你所需蛋白量很少，该试剂盒也是非常不错的选择）。Mini或Maxi Kit利用单管进行反应，产物可达600μg/ml。将模板和EasyXpress Mini或Maxi Kit中提供的各种试剂混合后在室温孵育, 只需1小时就表达出蛋白啦，从而可以快速对表达模板进行筛选。图1就是一个实际例子，对于TFⅡA来说，在C端加上Strep标签有助于获得最优蛋白产量；而对于TNFα只要在N端加上His标签就能达到高产目的。等确定了最优模板，要想进行大量蛋白制备，接下来的事情就简单了。如果时间紧，那么推荐使用EasyXpress Protein Synthesis Mega 或 NMR Kits 进行体外表达，你就很轻松的在4小时内获得5 mg蛋白。之所以能够突破体外表达常见的不能获得大量蛋白的瓶颈，原因在于在实验体系放大到50 ml试管进行反应之前，QIAGEN利用胶过滤方法去除小分子抑制剂得步骤（已经有研究证明，这些小分子抑制剂是使蛋白不能进行体外表达的罪魁祸首）。从这两款试剂盒获得的蛋白可分别用于蛋白晶体培养或者利用利用NMR研究其三级结构；如果时间充裕，也可进行传统的体内表达。

     体外表达相比体内表达的另一个优势是可以直接合成标记蛋白。EasyXpress E.coli Kits体外表达系统耐受性高，用来合成标记的蛋白最合适不过。除了放射性标记氨基酸，QIAGEN还有2种体外表达试剂盒，可以进行定点或随机性的生物素标记。一个是生物素标记的Lys，可选择显色或者化学发光检测法，满足一般实验的需要。有关EasyXpress E. coli kits涉及到的各种试剂盒的相关信息见表1。到目前为止EasyXpress E. coli kits已经成功用于多种蛋白的表达，感兴趣的读者可以浏览下面的网页获得更多信息：http://www1.qiagen.com/Products/Protein/Expression/EasyXpress/

表1 EasyXpress E.coli Kits一览表

    现在来关注一下EasyXpress Insect真核蛋白的体外表达系统。真核细胞表达比原核表达更痛苦，因为转染，真核细胞的培养等等复杂操作，还有细胞株的类型，启动子的选择，表达量，太多因素困扰和干扰真核细胞表达。但是真核细胞独有的翻译后加工有时是必须的。我们都知道大多数真核蛋白需要带有正确的翻译后修饰如磷酸化，糖基化及信号肽剪切等，才能行使其生物学功能。目前市场上的真核体外体系还有有兔网织红细胞及麦胚抽提物体系。而QIAGEN的EasyXpress Insect Kit II作为一种新型的真核体外翻译系统，采用优化的 Spodoptera frugiperda（草地夜蛾）细胞抽提液，该抽提液中包含了体外翻译需要的各种成分(如 ribosomes, ribosomal factors, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases等)，用于表达带有翻译后修饰得真核蛋白（见表2）。需要指出的是该试剂盒对模板的要求是T7启动子。产量与第一代试剂盒相比上升了3倍，每次制备可以获得2 µg蛋白。与其他真核体外体系的不同之处在于，EasyXpress Insect Kit II的抽提液中还包含表达翻译后修饰蛋白所必需的功能器官膜组分，无需任何添加物就能获得真核蛋白。除此之外, QIAGEN还提供EasyXpress pIX4.0 Vector 用于制备最优的表达模板，然后利用EasyXpress Insect Kit II进行体外表达。

表2 EasyXpress Protein Synthesis Insect Kit成功合成的真核蛋白列表

    以上是对QIAGEN体外表达产品的一个简单介绍，如果你正在进行蛋白表达，同时正因为时间紧而发愁不能按期毕业，那么就来试试EeayXpress System吧，肯定能给你带来意想不到的惊喜！想要了解更多QIAGEN体外表达产品的信息，请浏览http://www1.qiagen.com/Products/Protein/Expression/EasyXpress/