专家指南：如何从FFPE样品中提取DNA？（二）[心得点评]

从FFPE样品中提取DNA之后，怎么评估DNA的质量，怎么优化实验呢？来，让我们听听专家的意见。

问题三：你如何优化DNA提取的效率？你认为怎样才算是好的产量？

Sunil Badve 印第安那大学药学院
延长蛋白水解酶的作用时间。大于100 ng/ul就算是好的产量吧。

Mark Bouzyk 爱默里大学（EMORY UNIVERSITY）药学院
提取过程的关键是蛋白酶消化要持续2-3天。我们发现如果只消化几小时的话，提取的效果就不大好。根据我们的经验，好的产量是从3个5um切片中得到1-3ug的DNA。当然，这在很大程度上是由切片本身的质量来决定的。

Susan Long 俄亥俄州立大学医学院
你必须确保这些组织在上QiaAmp柱之前，已经消化完全了。从10-20个小的组织切片（小于5mm2）一般能得到5-10ug的DNA，而3-5个大的组织切片（大于5mm2）的DNA产量一般在40ug或更多。

Jeffrey Mason 美国国防病理中心
提取效率与蛋白酶K消化步骤密不可分。延长消化时间能改善DNA的回收率以及片段的平均长度。蛋白酶K的消化步骤最多可延长到5天，每天加入新的消化液。如果组织还没有完全溶解的话，就要继续消化。最后结果应该是表面光滑的半透明溶液，看不到任何微粒。孵育时间也取决于组织。例如，低密度组织（肺）所需的孵育时间就比高密度组织（心脏）少。
我认为好的产量应在200-500 mg/ml。DNA浓度可以通过吸光度或荧光分析来测量。

问题四：你如何确定提取的DNA的质量？你可以接受的片段化程度？

Sunil Badve 印第安那大学药学院
A260/A280在1.7与1.9之间。我们没有考虑它的片段化程度。

Mark Bouzyk 爱默里大学（EMORY UNIVERSITY）药学院
我们通常使用PicoGreen来测定DNA的数量和质量。我们大部分的下游分析是Taqman或单碱基延伸基因分型，所以500bp左右的片段都是可以接受的。但有时可能需要更长的片段（比如Illumina Infinium就需要2kb），我们推荐用Agilent的生物分析仪来测量片段化大小，与常规的凝胶电泳相比，它需要的样品量很少。

Susan Long 俄亥俄州立大学医学院
我是通过Nanodrop分光光度计来检测浓度和260/280比值的，然后进行PCR。通常我只需要能扩增出200-400bp的片段就行了。

Jeffrey Mason 美国国防病理中心
我们利用两种方法来估计DNA的质量。第一种是在70度变性DNA，然后取200ng去跑1%的琼脂糖胶，来确认大小分布。大小应该是分布在100bp到3000bp之间。如果用蛋白酶K消化6天以上，还可以看到更长的片段。第二种方法是通过实时定量PCR来估计DNA的质量。我们会用3-4套引物及1-2个探针来扩增看家基因GAPDH或b2微球蛋白。
对于实时定量PCR而言，100bp到3000bp的DNA片段就能得到一个理想的结果。如果是要做芯片研究的话，可能需要更长的片段。

从上面他们的谈话中，你可以看到样品不同，下游的分析不同，从FFPE样品中提取DNA的步骤也会有所差异。希望你能从他们的经验中汲取精髓，摸索出最适合你的DNA提取方法。我们还挑选了一些相关文献，帮助你优化实验。

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（生物通 余亮）