BioRad Experion自动电泳系统也能实现银染的灵敏度[创新技巧]

【字体: 时间:2008年08月11日 来源:生物通

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  为了改善Experion自动电泳系统的灵敏度,Bio-Rad的研究人员最近开发了一种用荧光染料预标记蛋白的新方法,可使Experion的灵敏度增加80-500倍,与PAGE胶的银染结果相媲美。

毛细管电泳是分离SDS-蛋白质的常用手段。它具有效率高、速度快、样品和试剂消耗量少的特性,但最大的缺点就是在上样之前要做大量的准备工作,不但增加了分析时间,还限制了通量。

自动化的微量电泳系统因其在分离SDS-蛋白上的快速、便利,而替代了传统的毛细管电泳仪。例如,Bio-Rad的Experion自动化电泳系统是基于芯片的分离系统,能在30分钟内处理10个样品。它覆盖的蛋白分子量范围为10-260 kD,分辨率与4-20%的梯度胶类似。该系统还采用了动态的染色-脱色化学技术,以及荧光检测,不过灵敏度就不算太高,仅仅与考马斯蓝染色相当。

为了增强Experion系统的灵敏度,在制备生物制品时能检测到更低水平的杂质,Bio-Rad的研究人员最近开发了一种方法——用荧光染料预标记蛋白。实验表明,在电泳之前用Alexa Fluor 647染料标记蛋白,会使Experion的灵敏度增加80-500倍,可与PAGE胶的银染结果相媲美。他们还研究了染料与蛋白的摩尔比所产生的影响。

实验流程如下:

这种新方法所带来的灵敏度增加归结于荧光强度的增强,以及样品制备步骤的调整。同时染色步骤的改进也有助于降低荧光背景。你实际上得到的灵敏度依赖于染料和蛋白的摩尔比,以及信号的增强与峰值的变宽之间的平衡。研究人员用不同量的Alexa Fluor 647预标记BSA,并用Experion系统分析。结果表明,当染料与蛋白的摩尔比为1:100时,灵敏度比未标记时增加了500倍,但同时也观察到显著的峰值变宽。这意味着在灵敏度增加的同时,分辨率有所下降。

这种预标记的新方法不需要对Experion仪器做任何硬件或软件上的改变,只需要使用Experion Pro260芯片和Experion Pro260分析试剂盒中的试剂,再加入简单稀释的缓冲液和染料即可。通过比较Experion系统与SDS-PAGE中IgG重链的条带强度,表明Experion系统所能达到的灵敏度与PAGE胶的银染相当。由于这两种技术中条带的强度都依赖于碱性基团的数量,因此银染和Experion系统的检测极限都随蛋白的变化而变化。总的来说,用荧光染料预标记蛋白的新方法拓宽了Experion系统的检测能力,使它能用于检测生物制品中的痕量物质,及单克隆抗体制备中的杂质。

如果你想详细了解这项技术,请点击以下链接下载详细的技术指南:http://www.bio-rad.com/cmc_upload/Literature/218750/Bulletin_5719A.pdf

(生物通 余亮)

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