广东省疾控发布测定奶粉中三聚氰胺的方法

广东省疾控中心近日发布食品中三聚氰胺的测定方法，并举办了培训班，对市和县疾控中心的技术人员进行了培训。

　　

1 原理
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本方法采用20%甲醇溶解样品，5%三氯乙酸沉淀蛋白，提取样品中的三聚氰胺，经液相色谱仪C18柱分离，检测波长235nm条件下进行检测。

2 试剂
使用优级纯、色谱纯试剂，色谱用水符合GB/T6682一级水的规定。
2.1  20%甲醇溶液：甲醇+水(2+8) 
2.2  5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5g溶解于100mL水中。
2.3  乙腈
2.4  混合液：称取2.10g一水合柠檬酸和1.88 g己烷磺酸钠，溶于水中，稀释至1000mL混匀。
2.5  流动相：混合液（2.4）+乙腈（2.3）=92+8。
2.6  标准储备液配制：准确称取三聚氰胺标准品0.1000g，用20%甲醇溶液（2.1）定容至100mL。三聚氰胺含量为1.00mg/ mL，于4℃冰箱内避光保存。
2.7三聚氰胺标准系列的配制：准确吸取标准储备液(2.6)0.100mL；1.00mL；2.50mL；5.00mL； 10.00mL至100mL容量瓶中，并用20%甲醇溶液（2.1）定容至刻度。配制成三聚氰胺浓度分别为1.00mg/L；10.0mg/L；25.0mg/L；50.0mg/L；100mg/L的标准系列。

3仪器和设备
3.1 液相色谱仪：附二级管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV）
3.2 超声波清洗器
3.3 超速离心机
3.4 涡旋混合器
3.5 滤膜：0.45μm

4 分析步骤
4.1 试样处理：将奶粉样品混匀，准确称取样品1～5g于50mL比色管中，加入20%甲醇溶液（2.1）约35mL，震荡混匀，超声提取5min，加入5%三氯乙酸(2.2)5mL，并用20%甲醇溶液(2.1)定容至刻度，摇匀。以3000rpm/min超速离心5min。取上清液经0.45μm滤膜过滤，备用。
4.2 色谱参考条件
4.2.1 流动相：10mmol/L己烷磺酸钠+10mmol/L柠檬酸∶乙腈=92∶8；
4.2.2 流速:1.0ml/min；
4.2.3 柱温：35℃；
4.2.4 检测器：二极管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV），波长235nm；
4.2.5 色谱柱：C18柱子250mm ×4.6 mm，5μm；
4.2.6 进样量：10～20μL
4.3 色谱分析：进样10～20μL标准使用液及样品处理液于高效液相色谱仪中，以保留时间及光谱定性，以样品峰面积与标准系列比较定量。

5 结果计算
样品中三聚氰胺含量按下列公式进行计算。
    X=C×V×1000/(m×1000)
式中：X—样品中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C—从曲线上查出样品中三聚氰胺浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V—样品中总体积，单位为毫升（mL）；
m—样品质量，单位为克（g）。

6 色谱图

图1三聚氰胺标准高效色谱图（1—三聚氰胺）

图2 三聚氰胺标准品紫外吸收光谱图

图3 奶粉样品三聚氰胺液相色谱图（1-三聚氰胺）

图4 奶粉样品中三聚氰胺的紫外吸收光谱图

7精密度
在重复性条件下获得的两个独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。  

8 其它
8.1 标准曲线及线性范围
在上述实验条件下，分别取三聚氰胺标准使用液0.911、9.11、22.8、45.6、91.1mg/L，以峰面积对比浓度绘制标准曲线，结果如下：
线性方程及相关系数： A=81.7c+56.3  r=0.9999  
              式中：A—峰面积；c—浓度，单位为毫克每升（mg/L）
8.2 方法最低检出限
参考取样量，定容量和仪器进样量等因素，提出本方法的最低检出限为5 mg/kg。
8.3 精密度实验（n=7）
按此方法测定奶粉中三聚氰胺含量，平行测定7份，数据见表1。
表1 奶粉中三聚氰胺测定的精密度实验结果
  测定次数 含量(mg/kg)
    1         45.8
    2         46.8
    3         46.7
    4         46.2
    5         46.2
    6         45.9
    7         46.0
  平均值      46.2
  RSD（%）     0.9

8.4 回收实验
   采用添加回收实验来考查方法准确度，测定奶粉中三聚氰胺加标回收实验结果见表2。
表2 奶粉中三聚氰胺加标回收实验结果
样品名称 本底值mg/kg 加标量mg/kg  测量值mg/kg 回收率(%) 平均回收率（%）
  奶粉1     616         89.2         702          96.4       98.5
                                     701          95.3 
                                     704          98.7 
                        364          978          99.5 
                                     967          96.4 
                                     962          95.1 
                      1.46×10³    2.10×10³      102 
                                   2.10×10³      102 
                                   2.09×10³      101 
  奶粉2     73.9         89.2        162          98.8         99.5
                                     160          96.5 
                                     158          94.3 
                         364         429          97.6 
                                     438          100 
                                     450          103 
                      1.46×10³    1.55×10³      101 
                                   1.57×10³      102 
                                   1.57×10³      102 

8.5 干扰实验
8.5.1 试剂空白测定 结果显示试剂在三聚氰胺的保留时间均没有干扰峰出现。
8.5.2 按照GB10766-1997等规定对配方奶粉添加营养素中的维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、生物素、叶酸、泛酸钙、烟酸、烟酰胺进行5倍添加量干扰试验，结果未见干扰。
8.5.3  采用紫外检测器(UV)测定结果如为阳性，建议采用二极管阵列检测器（DAD）或质谱（MS）进一步确认。

参考文献：
1、 中国人民共和国农业行业标准 NY/T 1372-2007 饲料中三聚氰胺的测定
2、 汪辉，曹小彦，彭新凯，陈利国等 高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺 [J] 食品与机械，2007年10月，第23卷第5期
3、 张美金，林海丹，林峰，李荀等 高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中三聚氰胺含量 [J] 中国卫生检验杂志 2007年12月第17卷第12期
4、 Wendy C Anderson, Sherri B. Turnipseed, Christine M. Karbiwnyk, and Mark R.. Madson Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC chromatography Laboratory Information Bulletin LIB No.4396 Volume 23, May 2007