[新品推荐]RIP技术：研究肿瘤发生和转移中microRNA失调的有力工具

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。本文就带你去了解这种新兴技术。

作者：钟丹丹博士

microRNAs（miRNA）是一种内源性非编码小分子RNA，一般具有18到25个核苷酸，其序列在进化上高度保守，通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。

miRNA是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptional control）中重要的调控因子。首先，miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）复合物中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通过不完全的碱基互补靶向到目标mRNA的3’UTR区，再通过引导酶切影响了mRNA的稳定性，或直接阻碍翻译过程，从而介导特异mRNA靶标的转录后基因沉默。
 

miRNA参与转录后调控网络。miRNA靶向到目标mRNA的3’UTR区，抑制靶mRNA的蛋白表达。（摘自Chatterjee & Pal, Biol Cell. 2009）

miRNA对许多生理过程产生重要影响，如细胞生长、凋亡、应激应答、干细胞分化潜能的维持以及新陈代谢等。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。

对miRNA的研究表明，miRNA表达量的上调或是下降都可能与致癌基因或是抑癌基因的调节有关，因此miRNA在癌症生成中起重要的作用。通常而言，与发生分化了的细胞类型有关的miRNA在肿瘤细胞中的表达减少，而那些在早期发育及干细胞中便有所表达的miRNA却保留下来。

一些在肿瘤中过度表达的miRNA通过下调抑癌因子而促进肿瘤发生，如：
― 在肝细胞癌中高表达的miR-21，靶向抑癌基因PTEN ；
― 在淋巴瘤中高表达的miR-17-miR-92簇，靶向抑癌基因E2F1；
― 在睾丸生殖细胞肿瘤中高表达的miR-372和miR-373，靶向抑癌基因LATS2。（摘自：Lujambio,AEsteller,M Cell Cycle 2009）

同时，一些在肿瘤中表达缺失的miRNA起着抑制癌症的功能，如：
― 在肺癌中中低表达的lethal-7（let-7）miRNA家族，靶向致癌基因KRAS、NRAS、MYC和high mobility group A2 (HMGA2)；
― 在睾丸癌和套细胞淋巴瘤中低表达的miR-15a-miR-16-1簇，靶向致癌基因cyclin D1。

值得注意的是，这些miRNA的作用是组织和肿瘤特异性的，例如miR-155在白血病和淋巴癌中是高度表达的，并起着原癌基因的作用，而miR-155在内分泌肿瘤中表达极大地下调，很可能对内分泌肿瘤具有抑制作用。

最新的研究发现，许多miRNA参与晚期癌症的特征--癌细胞扩散过程的调控，这些miRNA通过同时作用多条信号通路并靶向不同目标蛋白基因而对癌细胞扩散起激活或抑制的功能（详见下图）。
 

肿瘤转移中miRNA调控的信号通路。在癌症恶化过程中，通常表达上升的miRNA以红色方框表示，而表达下降的miRNA以灰色方框表示。有助于上皮细胞-间充质转化的蛋白编码基因以绿色方框表示。EMT：epithelial-mesenchymal transition，上皮细胞-间充质转化； ECM： extracellular matrix，胞外基质。（摘自Nicoloso etc., Nature Rev. Cancer 2009）

由于miRNA被发现在癌症机理中起重要的作用，尤其是与肿瘤转移相关联，因此对于miRNA的研究来说，最让人兴奋的是有希望应有于癌症治疗中的RNA 抑制疗法或模拟miRNA表达疗法，尤其是对于出现肿瘤转移的癌症病人的治疗。

但是miRNA具有成百上千个靶标，所以要完全理解一个miRNA和靶标的特异性反应与肿瘤发生之间的联系，是一项非常具有挑战性的工作，尤其是在癌症研究中鉴别出miRNA的准确靶点仍然是一大难题。现已知道miRNA的调节功能是通过结合不同的蛋白质或RNA来实现的，因此研究miRNA与蛋白的结合情况对于揭示miRNA的功能及指导RNA疗法的研发具有重要意义。Robert Nakamura博士是Advanced Genetic Systems公司的首席执行官，作为验证RNA-蛋白复合物作为治疗靶点有效性的专家，他认为“我们知道RNA结合蛋白在不同的生理状态下会结合不同的RNA。通过从细胞中分离完整的RNA-蛋白复合物，我们可以确认分子间的特异性相互作用，从而有希望为治疗疾病找到破坏这些相互作用的方法。”

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。

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Millipore基于磁珠的RIP实验流程

RIP 实验基本原理：

• 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白
• 防止非特异性的RNA的结合
• 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来
• 结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定

延伸阅读：95%的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码RNA，真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此，RNA研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法，帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。