细菌人工染色体（BAC）测序流程的优化[创新技巧]

细菌人工染色体（BAC）DNA的测序比质粒或PCR产物的测序要困难得多。它片段长（一般大于100 Kb），会形成二级结构，可能由于二级结构区域后的DNA链延伸不够充分而导致测序异常。怎么解决这些问题？让我们来看看瑞士苏黎世大学Escher女士的答案吧。

Eliane Escher是瑞士苏黎世大学分子生物学研究所测序中心的管理者。这个研究小组每月常规进行1500到2000个测序反应，以质粒、PCR产物和细菌人工染色体（BAC）DNA作为循环测序的模板。Escher女士利用BigDye® Terminator循环测序试剂盒、GeneAmp® 9700 PCR系统和3730 DNA测序仪，以一种改进的方法*对BAC DNA进行测序。此外，Escher女士的研究小组发现利用BigDye® XTerminator™纯化试剂盒进行反应纯化，能增加信号强度，并从整体上改善序列数据的读取质量，产生与质粒模板相当的结果。

关于细菌人工染色体（BAC）

一般说来，细菌人工染色体（BAC）DNA的测序比质粒或PCR产物的测序要困难得多。它片段长（一般大于100 Kb），会形成二级结构，可能由于二级结构区域后的DNA链延伸不够充分而导致测序异常。BAC测序需要毫克级高纯度的DNA，从而获得充足信号，以利于准确的碱基信号检出和最大读长。

细菌人工染色体（BAC）测序流程的优化

Escher女士所在测序中心的工作量很大，他们需要一种省时又经济的测序方法来对细菌人工染色体（BAC）样品进行常规分析。从过夜培养的细菌培养物中纯化细菌人工染色体（BAC） DNA，然后用BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒在GeneAmp 9700 PCR系统上进行测序。Escher女士最初使用的步骤是针对质粒和PCR产物测序而开发的热循环条件。然而，这种方法导致BAC DNA序列质量不高，以及大量未掺入的染料终止子（“染料团”）。

为了解决这个问题，Escher女士修改了*热循环条件，延长最初的变性步骤，并增加了测序循环的数量。她还在先采用了BigDye XTerminator 纯化试剂盒进行循环测序反应产物的纯化，然后才用美国应用生物系统公司的3730 DNA测序仪进行毛细管电泳分析。同时平行分析质粒模板作为对照。11个独立样品的分析数据显示与初始步骤相比，结果有了很大改善。

更高质量的BAC序列数据

Escher女士发现，用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒及改良的步骤，使BAC DNA的测序质量达到甚至超过质粒测序中所得到的结果。在测序流程中加入BigDye XTerminator纯化试剂盒，能极大改善大型细菌人工染色体 DNA样品测序所面临的挑战。与Sephadex纯化相比，BigDye XTerminator纯化试剂盒纯化的BAC序列数据的信号强度显著得到改善。根据Escher女士的实验结果，在BAC测序中使用BigDye XTerminator纯化试剂盒可稳定地去除染料污染，从而消除了干扰序列分析的假象。关于Escher女士使用的操作步骤，请参考美国应用生物系统公司的应用指南“从细菌人工染色体（BAC）DNA获取高质量的测序数据的流程”，P/N 107AP05-01 (www.appliedbiosystems.com)。

图1. 改进*的热循环条件和BigDye XTerminator纯化试剂盒纯化让细菌人工染色体BAC DNA测序生成了高质量的序列数据。BAC DNA用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒的改进步骤进行测序。Sephadex（A组）或BigDye XTerminator纯化试剂盒（B组）分别用于测序反应的纯化。蓝色的条代表相应碱基的QV**值。（数据来自瑞士苏黎世大学分子生物学研究所E Escher）。**质量数值（QV）是确定测序数据质量的既定参数。QV>20，一般认为可以接受，说明该碱基被误读的可能性不高于1%。

*这个操作步骤是对美国应用生物系统公司推荐的 BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒操作步骤的一种修改。本文展示的结果来自提供结果的实验室，在您的实验设置中可能需要经过优化以获得最好的结果。请注意美国应用生物系统公司仅在按照推荐步骤、试剂配方、试剂盒储存条件进行操作时为BigDye Terminator循环测序试剂盒的性能提供支持。

利用BigDye XTerminator纯化试剂盒进行有效的纯化
BigDye XTerminator纯化试剂盒用一种简单的纯化方法对DNA测序反应进行纯化，并增加了纯化后样品的信号强度。纯化反应在40分钟内完成，只需要10分钟的手工操作。

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