优化仪器设置和测量参数进行荧光和化学发光的动力学测量[创新技巧]

作者：Reija-Riitta Harinen, Jorma Lampinen, Marika Raitio. ThermoFisher Scientific Oy, Vantaa, Finland.

摘要

在动力学测量中，仪器设置和测量参数取决于荧光和化学发光的反应速度，正确的设置是进行成功实验的关键。本文列举了过氧化氢/过氧化物酶检测（荧光法）、ATP检测（化学发光法）、钙离子检测（化学发光法）三种类型的动力学实验，通过这些实例来展示如何根据反应速度来选择仪器设置和测量参数的方法。

介绍

在酶标仪上进行荧光和化学发光测量的优势在于可进行高通量的测量。为了获得最佳的实验结果，反应的动力学速度将决定所需仪器的必备条件和测量参数的设置。如果需要通过向微孔板中加入试剂开始反应，那么选择手工加入试剂（如移液枪）还是使用自动进样器分液，这取决于该反应的速度。如果加入试剂后，反应的荧光或化学发光信号迅速上升，达到峰值后迅速下降，那就意味着手工加样不能满足检测的需要。这是因为加样后检测的时间延迟会降低反应的检测灵敏度，因此具有快速动力学特点的反应必须在配备有自动进样器的仪器上进行。特别的，如果反应速度极快，这就要求仪器不仅需要自动进样器，而且分液位与测量位必须在同一位置，只有这样才能保证实时跟踪反应的进程。

在一些动力学测量中，往往要求在加入试剂开始反应前先测量一段基线信号。对于这样的应用，用户必须能够对动力学测量过程进行设置，使得分液可以在动力学测量的特定时间点进行。

对于在微孔板上进行的动力学实验，根据需要选择进行“整板”、“单孔”或“组”（多个孔）进行测量十分关键。如果属于快速动力学反应，那么必须在完成第一个孔中的所有操作步骤（如分液后读数）后才能继续下一个孔的测量，即以“单孔”的方式进行实验。否则，当测量其它孔时，会损失信号强度，或将无法获得正确的动力学起飞点数据。而如果动力学之间的间隔时间足够长，那么可以将试剂先预分至所有孔中，然后以“整板”的方式进行测量。当然，也可以根据反应速度，选择多个孔构成一组，以“组”的方式进行。

分液器的设置也是十分重要的。在软件中必须能够对分液速度进行优化，粘度越大的液体需要更快的分液速度。优化的分液速度还能保证所加入的试剂与孔中原有溶液之间的充分混合。如果分液速度过低，将导致孔内溶液的混合效果不好，而速度过快，试剂就有可能溅出孔外。

在当前的一些应用中，常常包括了多个分液步骤，这就要求仪器具有配备多个自动进样器的能力。例如，双报告基因检测系统DLR（Promega, USA）需要两步的试剂分液，因而二个自动进样器对于DLR实验而言是必须的。

材料与方法

所有的荧光和化学发光实验都在Varioskan Flash全波长多功能读数仪（Thermo Scientific）上进行。使用SkanIt软件（Thermo Scientific）进行参数设置。

Amplex® Red过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒（Invitrogen, USA）应用于荧光的动力学检测。在过氧化物酶的存在下，Amplex Red试剂与过氧化氢反应生成异吩恶唑酮（Resorufin），该化合物可通过荧光法检测，激发光波长550nm，发射光波长590nm。取50ul终浓度为100uM的Amplex Red和2mU/ml的辣根过氧化物酶（HRP）混合液，加入96孔黑板Microfluor 1（Thermo Scientific）中，进行荧光动力学检测。选择在动力学起始点或第五个时间点加入50ul浓度为10uM的H2O2激活反应。

使用两种类型的ATP检测试剂用于化学发光的动力学检测。一种是CheckLite™ HS Set（Kikkoman Corp., Japan），另一种是ATP Biomass HS Kit（Biochemist AB, Sweden）。这两种试剂盒的反应原理都是通过萤火虫荧光素酶催化底物D-luciferin和ATP产生化学发光，但前者属于快反应（flash，闪光型），后者属于慢反应（glow，辉光型，发光持续时间更长）。取30ul的0.01uM ATP加入384孔白板Microlite 1+（Thermo Scientific），然后通过自动进样器分别加入闪光型或辉光型的30ul试剂后开始反应。对于闪光型反应，测量的积分时间是1s，动力学时间间隔为0（即以仪器所具有的最小动力学时间间隔进行测量），反应总时间10min。对于辉光型反应，积分时间是500ms，1min时间间隔，反应总时间60min（即60+1个时间点）。

另一个实例是反应速度极快的化学发光反应——应用水母发光蛋白（Aequorin）检测钙离子。Aequorin是钙离子的特异性指示剂，可以与钙离子结合产生蓝色的化学发光信号。取1pmol的AquaLite®重组Aequorin（Invitrogen, USA）加入96孔白板Microlite 1+（Thermo Scientific）中，通过自动进样器加入10ul的500mM CaCl2溶液进入微孔板中激活反应。测量的积分时间是10ms，间隔时间0，反应总时间10s。

结果

在不同时间点（起始点和第五个动力学点）加入H2O2激活Amplex Red反应的荧光动力学曲线，如图1所示。在SkanIt软件中，可以灵活的设置动力学过程中的分液时间点，见图2。选择在动力学的起始点就分液启动反应，则检测所得的信号就是反应的荧光强度。而在第五个时间点加入试剂，则动力学过程测得的前4个点数据代表的是反应的荧光本底信号水平，软件生成的动力学曲线将自动扣减本底。

图1. Amplex Red反应的荧光动力学曲线。RFU表示相对荧光强度。蓝色线代表在动力学起始点就加入启动试剂，而红色线代表在第五个动力学时间点加入试剂。
 

图2. 在SkanIt软件中，可任意设置动力学过程中的分液时间点。

闪光型和辉光型化学发光反应的动力学曲线如图3所示。对于闪光型反应，化学发光信号在自动进样器分液后的4s达到信号的峰值，然后化学发光信号水平迅速下降，其信号半衰期约为2min。这一结果表明，对于闪光型化学发光反应，使用自动进样器是必须的。因为手工加样无法跟上反应的快速进行，将会严重降低反应的灵敏度。此外，该动力学过程必须以“单孔”的方式进行，只有在完成一个孔的所有动力学检测后才能对下一个孔继续测量。

图3. 闪光型（A）和辉光型（B）化学发光反应的动力学曲线比较。

对于辉光型反应而言，化学发光的信号水平在一定时间内是相对稳定的。试剂加入后的1min内，化学发光强度达到峰值，之后缓慢下降，即使是1小时后，反应仍有约70%的化学发光信号水平。因而，对于这样的反应，可以对整板进行手工分液后再检测。少许的时间延迟对反应的检测并没有太大的影响。但使用自动进样器分液，对于辉光型反应，可以获得比手工分液更好的数据重复性和可靠性。

闪光型和辉光型反应的速度不同，因而必须对软件作出相应的不同设置，如图4所示。对于闪光型反应，动力学的时间间隔必须足够短，因此动力学读数必须按“单孔”（well loop）的方式进行，即在一个孔中完成所有的步骤后再继续到下一个孔。而对于辉光型反应，分液和连续的动力学测量可以按“整板”的方式进行，这是因为动力学之间的时间间隔足够完成所有检测孔的测量。
 

图4. 闪光型和辉光型化学发光反应动力学在SkanIt软件中的设置。

水母发光蛋白（Aequorin）检测钙离子的化学发光反应动力学过程，如图5所示。通过自动进样器加入钙离子的0.5s后，反应的化学发光强度达到峰值，随后迅速下降，信号的半衰期为2s。10s反应时间后，残留的信号水平小于10%。对于这类反应速度极快的化学发光反应，必须在分液后立即进行测量，否则就会检测不到真实的化学发光反应强度。而且，自动进样器的分液位与测量位必须在同一位置，只有这样才能保证真正的没有延迟的分液后测量。在SkanIt软件的设置中，反应的积分时间必须设置的足够短，如本例的10ms，否则会损失反应动力学的真实细节。而检测方式，显然必须以“单孔”的方式进行。此外，还必须保证足够快的分液速度（见图6），以满足反应速度的要求。
 

图5. Aequorin检测钙离子的化学发光反应过程
 

图6. SkanIt软件中的分液器速度设置

结论

正确的荧光和化学发光的反应动力学检测取决于检测仪器的设置和测量参数。选择合适的仪器设置和优化的测量参数将能很大程度的改善反应的检测灵敏度。使用自动进样器可以帮助获得可靠的、重复性的测量结果，消除手工分液的误差。更重要的是，如上所述的多种反应类型，如果没有自动进样器是不能完成检测的。

赛默飞世尔科技的荣誉产品——Varioskan Flash全波长多功能读数仪可以配备多至3个自动进样器，满足多种试剂的分液需求。灵活的SkanIt软件，可以根据反应的速度创建动力学程序。测量可以在分液后立即开始，真正的无延迟分液后测量，这一点对于快速的动力学反应而言是至关重要的。动力学过程中的分液时间点可以根据用户的需要选择，生成的动力学曲线将自动扣除本底的信号水平。动力学的进行方式可以灵活的选择“整板”、“单孔”或“组”。对于快反应，必须选择“单孔”的方式进行，而对于慢反应，可以按“整板”或“组”的方式进行。自动进样器的分液速度可以跟据使用的溶液类型和反应速度进行优化。以上这些选择可以帮助用户在进行基于微孔板的动力学实验时，获得最大的检测效率和高质量的实验结果。

（赛默飞世尔供稿）