鉴定涡虫再生时表达的新型非编码RNA[创新技巧]

涡虫是一种非寄生的扁形虫（如Schmidtea mediterranea），200多年来一直作为发育和再生的研究模型[1, 2]。涡虫的再生能力源自成体全能体细胞，又称为新母细胞（neoblast）的动态群体。

近期的研究表明，可与小piRNA（PIWI-相互作用的RNA）形成复合物的PIWI/Argonaute家族蛋白，对于涡虫中新母细胞的功能来说是必需的[3-5]。这种复合物的人类同源类似物已经被鉴定，因此这项研究有助于进一步加深对人体中动态平衡和干细胞调节的了解。

利用新一代测序技术来鉴定小RNA

德国柏林Max- Delbrück分子医学中心Nikolaus Rajewsky教授属下的研究人员，与纽约的Pyrodigm及美国应用生物系统公司合作，利用新一代测序技术来分析再生涡虫中的小RNA部分。然后用实时定量PCR来验证这些结果。整个流程为RNA提取、小RNA文库制备、SOLiD™测序、数据分析、TaqMan分析的设计、实时定量PCR，以及测序和qPCR数据的关联。

将样品转变成小RNA文库。样品来自25个立即切除的涡虫尾部（A组样品）和25个切除尾部4.5天后再生样品的尾部（B组样品）。提取总RNA（TRIzol®试剂），用Ambion® flashPAGE™分样系统从5 ug总RNA中纯化小RNA（10-40 nt）。随后用SOLiD小RNA表达试剂盒将小RNA组分转化成扩增的文库。

SOLiD测序。利用SOLiD ePCR试剂盒，以乳液PCR（emPCR）的方法将小RNA文库扩增到微珠上，并根据标准的步骤在SOLiD分析仪上进行双重平行测序。

miRNA图谱分析的数据分析工具

美国纽约斯隆-凯特琳癌症研究中心生物信息学中心实验室的副主管Nicholas Socci博士，以及Rajewsky教授小组的Marc Friedlaender，分别改写了SHRiMP和miRDeep软件包中的代码，以接受SOLiD系统产生的数据并对此进行分析。在Socci博士的咨询公司-Pyrodigm（[e-mail]，纽约），代码改变，计算能力（约100个CPU的高性能计算集群）也提高了，原来需要1个星期的工作现在只需5-6个小时即可处理。之前与Rajewsky教授（miRNA领域的著名科学家）的合作让Socci博士的计算生物学特长发挥到了涡虫项目中，他的分析结果也体现在本文中。Socci博士提到：“仪器的表现非常好。所有的数据都是超高质量-按照相当严格的标准，至少50%的数据是有用的。当然，（数据的）质量也取决于操作的人。”

数据分析

所有的读数根据http://smedgd.neuro.utah.edu上公布S. mediterranea基因组草图进行定位。主要的定位程序来自http://compbio.cs.toronto.edu/shrimp/README的SHRiMP软件包中的rmapper-cs。该程序对colorspace序列和letterspace序列进行了混合的Smith-Waterman比对，去除了接头，并对产生的序列进行比对。总共有48-55%的读数与涡虫参考序列匹配（见图1）。4-6%的配对读数代表了涡虫中表达的miRNA。读数比对显示它们已经包括了所有已知的涡虫miRNA。第二个分析步骤采用了miRDeep 软件包[6]进行miRNA探索。除了已知的涡虫miRNA，还鉴定出48个新的miRNA，包括10个用其他深度测序平台未检测到的miRNA。

图1. 涡虫中小的非编码RNA的长度分布（柱状图）。A组. 所有的读数作为比对长度的函数，而每一轮单独作图。A1和A2轮（深橙色、浅橙色）是截肢动物的技术重复，B1和B2轮（蓝色、绿色）是再生动物的技术重复。数据用总的读数来标准化。B组. 这个读数的数据子集成功去除了3’接头。A组样品（切除动物）重复实验的平均值数据以橙色表示，B组样品（再生动物）则以绿色表示。误差棒显示了95%的可信度。

其余的95%配对读数包含了另一组非编码RNA，它们的最高峰在32 nt，丰度是miRNA的10倍。据报道涡虫的发育和再生需要大量的PIWI/piRNA复合物，因此这一组中可能包含了piRNA[3]。目前正进行进一步的研究来验证这个假说。

测序结果的定量PCR验证。为了验证这些结果，研究人员利用实时定量PCR来分析涡虫中已知miRNA，以及SOLiD系统测序新发现的miRNA的表达水平。TaqMan分析是利用定制的小RNA TaqMan分析通道（Custom Small RNA TaqMan Assay pipeline.）针对涡虫序列而设计的。A组样品的结果以及与SOLiD数据的比较如图2所示。

图2. 28个涡虫miRNA的实时定量PCR数据和SOLiD测序数据的比较。橙色的柱代表了TaqMan实时定量PCR分析的2（-dCt）值。Ct值根据mRNA内源对照ura4（AYO68123）来标准化。Ura4稳定表达于切除动物和再生动物中[3]。SOLiD分析仪计数以蓝色的正方形表示。

定量PCR的结果证实了涡虫miRNA的表达，以及大多数TaqMan分析结果与SOLiD数据很好地关联。下一步的研究将集中在B组样品的表达分析，并鉴定两组样品中差异表达的miRNA。由于本文比较的两种不同技术不可能得到完全一致的结果，因此会进一步研究造成差异的原因。订购信息，详见28-29页。

致谢
涡虫菌株由美国犹他州大学A Sánchez Alvarado赠与。

参考文献
1. Sanchez Alvarado A. (2003) The freshwater planarian Schmidtea mediterranea: embryogenesis, stem cells and regeneration. Curr Opinion Genet Develop 13:438−444.
2. Sanchez Alvarado A. (2006) Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell 124:241−245.
3. Palakodeti D, Smielewska M, Lu Y-C, Yeo GW and Graveley BR (2008) The PIWI Proteins SMEDWI-2 and SMEDWI-3 are required for stem cell function and piRNA expression in planarians RNA (14):1174-1186
4. Reddien PW, Oviedo NJ, Jennings JR, Jenkin JC, Sánchez Alvarado A (2005) SMEDWI-2 Is a PIWI-Like Protein That Regulates Planarian Stem Cells. Science 310:1327−1330.
5. Cebrià F, Newmark PA (2005) Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture. Development 132:3691−3703.
6. Friedlaender MR, Chen W, Adamidi C, Maaskola J, Einspanier R, Knespel S, Rajewsky N (2008) Discovering microRNAs from deep sequencing data using miRDeep. Nat Biotech 26(4):407−415.