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多重免疫检测中的超级明星[新品推荐]

【字体: 时间:2009年04月09日 来源:Applied

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  随着western blotting和免疫检测应用的不断扩展,我们需要多功能、高灵敏度的检测系统。美国应用生物系统公司的 Western-SuperStar™ 免疫检测系统能用于标准的蛋白免疫检测、蛋白磷酸化表位的检测,以及RNAi介导的基因沉默实验中蛋白knockdown的验证。

随着western blotting和免疫检测应用的不断扩展,我们需要多功能、高灵敏度的检测系统。美国应用生物系统公司的 Western-SuperStar™ 免疫检测系统能用于标准的蛋白免疫检测、蛋白磷酸化表位的检测,以及RNAi介导的基因沉默实验中蛋白knockdown的验证。

Western-SuperStar 免疫检测系统是一个完整的化学发光免疫检测系统,能高灵敏度地检测固定在膜上的蛋白,低至飞克级的蛋白也能检测。该系统包含了1,2-二氧环已烷的碱性磷酸酶(AP)底物-SuperStar底物,能快速灵敏地检测AP结合的抗小鼠或抗兔IgG二抗(图1)。

图1. Western-SuperStar™ 免疫检测系统的多个应用。

即时、长效的发光

SuperStar底物的光信号是即时的,在PVDF膜上20分钟内能达到最高强度,与辣根过氧化物酶(HRP)试剂的发光动力学相当。与HRP试剂不同的是,SuperStar底物的信号持久,能在底物孵育后24小时内的任何时间捕获图像(图2)。

图2. Western-SuperStar™发光动力学。已知量(总蛋白)的A431细胞提取物在12% Bis-Tris胶上电泳,并转移到PVDF膜上。用抗-GAPDH的抗体和Western-SuperStar™免疫检测系统(左)或HRP检测系统(右)进行印迹。底物孵育时间如图所示,每次曝光时间为30秒。

多种膜兼容性,可重复多次杂交

Western-SuperStar系统适用于PVDF膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜。用Western-SuperStar试剂检测的PVDF印迹能被轻松洗脱去除,并用不同的一抗重新标记杂交,最多可重复3次,实现在同一张膜上检测多种蛋白,以及对蛋白的上样量标准化。

应用:磷酸化表位的免疫检测

蛋白磷酸化的研究对细胞生物学的许多领域都很重要,包括细胞信号转导和疾病的机制。丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基的蛋白磷酸化调控了胞内信号通路的许多步骤。Western-SuperStar试剂及缓冲液的配方能检测目标蛋白的磷酸化表位。图3显示了利用多克隆抗磷酸化-EGFR抗体和EGF处理的A431细胞裂解液,对表皮生长因子的磷酸化酪氨酸表位进行免疫检测。利用Western-SuperStar系统,低至0.3 ug的细胞裂解液中也能检测到~175 kDa的磷酸化EGFR。

图3. 磷酸化酪氨酸的免疫检测。磷酸化的EGFR用多克隆的抗-磷酸化EGFR和AP结合的羊抗兔IgG进行检测。样品包括分子量标准,未处理的A431裂解液和连续稀释的EGF处理的A431细胞裂解液。底物孵育之后,立刻用CCD成像系统进行成像,时间为37秒。

应用:siRNA-介导的蛋白Knockdown

Western-SuperStar系统的高信号强度和灵敏度能检测飞克级的蛋白。这让它很适合于siRNA介导的蛋白敲除的实验。图4展示了用Western-SuperStar系统对siRNA介导的survivin蛋白knockdown进行验证。用Silencer siRNA(靶定survivin)转染Hela细胞,细胞裂解物电泳,并转移到PVDF膜上。Western-SuperStar系统检测survivin,然后洗脱去除印迹,用GAPDH对蛋白上样量进行归一化。

图4. siRNA介导的Survivin knockdown,用Western-SuperStar™免疫检测系统检测。利用siPORT™ NeoFX™转染试剂将Silencer® siRNA (Survivin, 30 nM) 或Silencer 阴性对照#1 siRNA (NC, 30 nM)转染Hela细胞。细胞裂解物(转染后24、48、72小时)电泳(10 ug蛋白/道,4-15% Tris-HCl胶),并转移到PVDF膜上。接着用Western-SuperStar系统及合适的一抗去检测survivin,然后剥离印迹,检测GAPDH。SuperStar底物孵育之后,立即用CCD成像系统进行成像(1秒)。NT=未处理的Hela细胞。

灵敏、功能多样、完整

美国应用生物系统公司的 Western-SuperStar免疫检测系统是多功能、高灵敏度的系统,能用于多个蛋白免疫检测的应用,包括磷酸化表位检测和RNAi介导的蛋白knockdown的验证。该系统的高信号强度、更优的发光动力学、多种成像模式、完整的试剂和配件组,以及与多种膜的类型兼容,让它成为多个western blotting应用中灵活完整的解决方案。

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