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一种更高效的体外表达系统[创新技巧]

【字体: 时间:2009年06月10日 来源:生物通

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  相对于常用的原核及真核表达系统而言,无细胞表达系统能更快速地生产蛋白,且抛开了培养细胞、转染等繁复的步骤,过程更简单,但不足是产量有限。最近,康奈尔大学的罗丹(音译)及其研究小组开发出一种方法,能让无细胞蛋白生产更高效。

大肠杆菌表达系统虽然简单,但对于蛋白的生产往往不是最佳的选择。那些毒性蛋白或经历快速水解的蛋白就更加不适于体内表达,此时,无细胞蛋白合成系统更具优势。无细胞表达系统中包含了蛋白生产所需的所有必要元件,这些元件来自细胞提取物或重组蛋白。相对于常用的原核及真核表达系统而言,无细胞表达系统能更快速地生产蛋白,且抛开了培养细胞、转染等繁复的步骤,过程更简单,但不足是产量有限。最近,康奈尔大学的罗丹(音译)及其研究小组开发出一种方法,能让无细胞蛋白生产更高效。

他们过去曾利用支链的DNA分子来制作水凝胶(hydrogel)。现在他们将这种新型的水凝胶首次应用到无细胞蛋白合成中。研究人员将支链DNA和线性的质粒连接作为部分的凝胶支架,并利用平的1平方毫米模具来制作20 um厚的凝胶垫。随后他们将包含基因的凝胶垫置于含无细胞系统的试验管内,并等待奇迹发生。

罗丹的研究小组利用这种水凝胶方法,合成了16种不同的蛋白,其中包括膜蛋白和毒性蛋白。就容积得率而言,他们获得了高达5 mg/ml的功能蛋白,效率比溶液中的无细胞合成高了300多倍。他们认为转录效率高的原因可能有以下三个。其一,凝胶基质覆盖了基因的自由末端,保护它免收核酸酶的降解。其二,凝胶中的基因浓度可以大大增加,而不会像溶液中那样产生DNA沉淀。其三,酶的周转可能更有效,因为酶不再需要扩散到很远去寻找它的下一个底物。

罗丹认为,高通量无疑是这项技术的一个优势。“我们能够大规模地合成蛋白,因为我们不需要培养细胞。”水凝胶系统对生产膜蛋白同样有用,因为增溶的去污剂能直接添加到表达系统中。“这对活细胞来说非常困难,因为去污剂会破坏细胞膜。”研究人员还合成了一种来自蚌类的“胶质”蛋白,它在大肠杆菌中通常会形成包涵体,甚至杀死细胞。

尽管制作凝胶垫需要洁净室和特别的微型模具,但罗丹还是期望将这种方法转变成商业产品。眼下,他还是很乐意协助其他人制作DNA水凝胶,用于蛋白生产和其他用途。(生物通 余亮)

原文摘要:
A cell-free protein-producing gel
Hisakage Funabashi, Nokyoung Park, Soong Ho Um, Jianfeng Xu, Dan Luo
Nature Materials 8, 432-437 (29 March 2009) doi:10.1038/nmat2419 Article

摘要:
Proteins are important biomaterials and are generally produced in living cells. Here, we show a novel DNA hydrogel that is capable of producing functional proteins without any living cells. This protein-producing gel (termed 'the P-gel system' or 'P-gel') consists of genes as part of the gel scaffolding. This is the first time that a hydrogel has been used to produce proteins. The efficiency was about 300 times higher than current, solution-based systems. In terms of volumetric yield, the P-gel produced up to 5 mg ml(-1) of functional proteins. The mechanisms behind the high efficiency and yield include improved gene stability, higher local concentration and a faster enzyme turnover rate due to a closer proximity of genes. We have tested a total of 16 different P-gels and have successfully produced all 16 proteins including membrane and toxic proteins, demonstrating that the P-gel system can serve as a general protein production technology.

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