微孔板细胞仪在高通量化高内涵RNAi筛选中的应用[创新技巧]

RNAi技术已经渗透到了生命科学领域的每个角落。而科学家们也不再满足于单个基因的RNAi研究，在这个高通量、讲效率的年代，基因组范围的RNAi研究才能让我们更快地了解更多新基因的功能。如何进行高通量化高内涵的RNAi筛选？TTP Labtech公司开发出一种独特的激光扫描微孔板细胞仪Acumen Explorer™，满足了筛选用户的急切需求。

从最初对RNAi的晦涩理解，到如今RNAi技术突飞猛进，虽然只有短短的十年，而RNAi技术一日千里。如今，RNAi药物已经从实验室迈入临床阶段。不得不说，RNAi技术渗透到了生命科学领域的每个角落。而科学家们也不再满足于单个基因的RNAi研究，在这个高通量、讲效率的年代，基因组范围的RNAi研究才能让我们更快地了解更多新基因的功能。此外，RNAi在基因沉默上的巨大威力让它迅速成为药物筛选的新宠，在药物靶点基因的鉴定上发挥着重要的作用。

如何进行高通量化高内涵的RNAi筛选？这恐怕要从微孔板读数仪说起。微孔板读数仪经过不断演化，已经从检测每个孔平均信号的光电倍增管进化到了解单细胞特征的显微镜样成像系统。目前的微孔板读数仪在读板速度和提取的信息量上差异很大。有的读数仪非常快，1分钟就能捕获板上的所有信息，但它们只能测量每孔中细胞群体产生的总体信号。而另一方面，高内涵筛选成像仪为每个孔提供了丰富的数据，但是，它们的扫描速度较慢，产生很大的数据文件，不利于高通量的大规模筛选。如何做到鱼和熊掌兼得？TTP Labtech公司开发出一种独特的激光扫描微孔板细胞仪Acumen Explorer™，满足了筛选用户的急切需求。

Acumen Explorer™能够对荧光标记细胞进行快速高内涵的筛选。它可配置单色、双色或三色激光，有205nm、488nm、633nm三种激光模式可供选择，确保能与广泛的荧光探针兼容。Acumen通过大视野广角镜头以激光扫描微孔板或玻片的底部，且读取数据的速度不受板密度的影响，因此无论是24孔板还是1536孔板，每块板的分析都只需要10分钟。为了适应分析开发、分析验证和筛选科学家的不同要求，Acumen产生的数据能以3种细节层次进行收集。在分析开发模式下，Acumen收集微孔板准中每一个细胞的多维信息，为分析方法的建立提供全面的数据；在高通量筛选模式中，在对所有细胞的信息分析完成后，软件仅报告所有的群体统计数据，将文件大小降低到50 KB，既便于管理，也省去了购买数据存储服务器的需要。Acumen能对贴壁及悬浮细胞，活细胞和固定细胞进行筛选，与所有符合SBS（Society for Biomolecular Screening）标准的平板兼容。这些特征说明Acumen非常适于RNAi库的表型筛选。本文就列举了Acumen微孔板细胞仪在高通量化高内涵RNAi筛选中的应用。

I. Acumen能够快速可靠的用于细胞周期相关基因的初筛
德国马普学会细胞生物学和遗传学部门的Ralf Kittler等专注于细胞分裂必需基因的研究，近来一篇使用Acumen用于细胞周期相关基因研究的文章发表在Nature的Cell Biology上¹。由于细胞分裂调节的缺陷会引发多种疾病，特别是白血病和其他癌症，因此，对人类细胞中细胞分裂必需基因的整体纵览不仅能加深基础生物学过程的了解，还可能为癌症带来全新的诊断和治疗靶点。

他们利用RNAi库进行基因组范围的整体研究。不过，他们使用的RNAi库可不是一般的siRNA，是由内切核酸酶制备的小干扰RNA，简称为esiRNA。与普通的单个siRNA对应单个基因不同，esiRNA集合了数百个针对单基因靶点的siRNA。这种新型武器能避免有效siRNA的反复筛选过程，迅速实现基因沉默，并确保脱靶效应最低。并且该方法的有效性在另一篇筛选Hela细胞增殖必须基因的研究文章中被证明过²。

为了鉴定Hela细胞中的细胞分裂基因，Kittler等使用Acumen开发出一种快速可靠的高通量DNA含量分析方法，作为细胞周期逃逸和倍体表型改变的最初检测（图1）。他们用靶定17828个基因的esiRNA库来转染384孔培养板中的细胞。72小时之后固定细胞，并用PI（Propidium Iodide）染色。随后用Acumen Explorer微孔板细胞仪进行扫描。通过分析Acumen Explorer软件生成的DNA含量直方图，定量细胞数目和subG1、G1、S、G2/M期、4N-8N和8N DNA含量细胞的百分比。之后对获得的DNA含量直方图进行打分。如果与阴性对照差异显著，就归为阳性（hit）。利用这些标准，他们找到了2146个改变细胞周期或倍体的基因。当然，筛选通常会由于实验误差而产生假阳性。而脱靶效应会让RNAi筛选的假阳性更多。为此，研究人员开发出三步的验证步骤，即通过荧光成像显微镜、流式细胞仪和时间延时摄像显微镜进一步分析。最终，利用初筛+三步验证，研究人员发现了1351个参与细胞分裂过程的基因，其中包括已经发现但还未报道与细胞周期有直接关系的882个基因，尚未被基因组数据库确定的252个基因，以及217个已经报道与细胞分裂有关的基因。而且这1351个基因中囊括了两个控制胞质分裂的进化保守的转录调控网络。

传统的使用CCD成像原理的细胞周期分析并不适用于这个分析，由于它只能获取每孔中极小部分细胞，因此在分析过程中无法使用全细胞数进行均一化，所获得的数据可靠性下降（例如由于细胞培养过程中的细胞分布不均匀的情况），Acumen的全孔扫描方法则有效的避免了这一缺陷。基于流式细胞仪的实验方法由于其实验方法的复杂性（例如，细胞需要重悬），整个实验时间可能需要7个月。而基于Acumen方法无需重悬细胞，实验周期只有7天，其中使用Acumen进行扫描和数据分析仅仅占了2.5天，并且获得了高质量的数据。而且基于模板式的分析方法避免了人工干预对实验结果的影响。可见Acumen在用于全基因组范围的高通量化高内涵RNAi筛选研究时，能够有效的提高速度和结果的可靠性。

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图1. 筛选策略（部分）

II  Acumen用于细胞分裂基因的初筛
TTP的研究人员与Ambion公司合作利用Acumen来筛选Hela细胞中siRNA和miRNA库的表型图谱^3,4。研究方法与上文相似，是用通过PI染色和Acumen Explorer™ 激光扫描荧光微孔板细胞仪来确定总细胞数，获得的数据用来显示细胞的增殖情况。相对于酶标仪实验方法而言，Acumen获得的数据更加可靠。因为传统的方法依靠的是酶与底物作用，但是在筛选中被测试的样品例如化合物就有可能干扰酶的活性，从而产生假阴性。Acumen则是直接扫描获得染色后的细胞核，通过对细胞核的计数来确定细胞的数量，其结果更加可靠。

Hela细胞中的siRNA活性分析
研究人员利用Silencer CellReady-96 siRNA库平板对Hela细胞进行筛选，并研究细胞增殖的变化。他们根据推荐的操作步骤，利用NeoFX将siRNA库中每个CMGC激酶的三个设计序列分别或共同转染Hela细胞。转染后72小时收集细胞，并将细胞固定，用PI染色来观察细胞增殖的变化。染色之后，用Acumen Explorer激光扫描荧光微孔板细胞仪来进行细胞计数。

图2显示了siRNA pool相对单个siRNA的干扰结果。3个siRNA中有2个起作用就作为阳性（hit）。并将该结果与siRNA pool转染的结果比较，发现大约半数（48%）的siRNA pool的结果与两个单个siRNA的结果不一致。此外，siRNA pool与单个siRNA分子相比，产生了更多的假阳性。

图2. siRNA pool相对单个siRNA的干扰结果

Hela细胞中的miRNA活性分析
microRNA（miRNA）是一类小分子RNA，在哺乳动物体内通过阻遏mRNA的翻译来调节mRNA基因表达。miRNA的研究这两年一直很火。在96孔板中，研究人员利用siPORT Neo-FX（Ambion）将miRNA抑制剂（5 pmole）反式转染Hela细胞，每个重复三次。转染后72小时，细胞用4% 多聚甲醛固定，再用0.1% Triton X-100透化处理，接着用PI染色。平板用Acumen Explorer微孔板细胞仪扫描，来确定细胞总数。采用全孔扫描模式，时间为每块板10分钟。为了了解miRNA功能抑制所引起的细胞形态变化，Hela细胞再用β-actin抗体和DAPI进行染色。
从大量的Acumen Explorer的筛选结果中，研究人员发现了miR-31、miR-190和miR-216的抑制会导致细胞增殖下降，而miR-21和miR-24的抑制则使细胞增殖增加（图3）。转染了miR-31抑制剂的细胞则被拉长，并表现出类似神经生长的膜突起（图4）。

图3. 改变细胞增殖的miRNA的鉴定

图4. miR-31转染对细胞形态的影响

III 总结
以上研究显示了Acumen微孔板细胞仪在高通量化高内涵RNAi筛选中的高速、有效和精确的应用特点，说明在未来的RNAi研究技术发展中，Acumen Explorer将成为有力的研究工具，为科研工作者提供更便利研究过程和更可靠的研究结果。

Acumen的在研究中的优势：
• 荧光标记细胞的高通量化高内涵筛选
• 全孔的4色同时分析
• 可同时筛选贴壁及悬浮细胞，活细胞和固定细胞
• 扫描和数据处理同步进行（低至每块板5分钟）
• 数据文件大小从最详细的350 MB（分析开发）到最快速的50 KB（筛选）
• 与所有符合SBS（Society for Biomolecular Screening）标准的平板兼容

这些特征与RNAi筛选研究高度兼容，表明在高通量化高内涵的RNAi筛选应用中，Acumen Explorer正发挥着其他仪器所无法比拟的优势。

参考文献：
1. Ralf Kittler, et al. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat. Cell Biol. 9, 1401-12 (2007).
2. Kittler, R. et al. An endoribonuclease-prepared siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division. Nature 432, 1036–1040 (2004).
3. Wayne Bowen, et al. High Throughput Profiling of siRNA and miRNA Libraries using Microplate Cytometry. TTP application note.
4. Angie M. Cheng, et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 4

阅读英文原稿：

Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis

Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells

High Throughput Profiling of siRNA and miRNA Libraries using Microplate Cytometry