[创新技巧] 没有P的qPCR

【字体: 时间:2009年07月06日 来源:生物通

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  qPCR中的P代表什么?Polymerase,聚合酶。如果qPCR少了聚合酶,你一定觉得这是在开玩笑,巧妇难为无米之炊,没有聚合酶,定量PCR还怎么做。当然也能做,不信请看下文。。。

qPCR中的P代表什么?Polymerase,聚合酶。如果qPCR少了聚合酶,你一定觉得这是在开玩笑,巧妇难为无米之炊,没有聚合酶,定量PCR还怎么做。

一直以来,研究人员在尝试创造自我复制的酶。实现这个目标的方法之一是用RNA酶来催化RNA分子的复制,包括RNA酶本身。这已经通过交叉催化(cross-catalytic)系统来实现了,它包括两个RNA酶,它们能利用四种底物成分来催化彼此的合成。

“R3C”就是一种能自我复制的RNA酶,但不是从核苷酸到核苷酸,而是通过碱基配对将两个RNA核苷酸连在一起。但是,这个过程效率很低,因为底物形成了无生产力的复合物,限制了指数级的增长,而倍增时间长达17小时。美国斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的Gerald Joyce和他的同事就一直在研究并改进“R3C”连接酶。

他们将R3C转变成交叉催化的形式,在那里正链酶将两个RNA分子组合起来,产生非常相似的负链酶,这个负链酶反过来又连接两个底物,形成正链酶。随后,Joyce他们利用体外演化(in vitro evolution)来改善这种RNA酶的催化性质。在他们的努力下,当加入新鲜的寡核苷酸和镁离子之后,这些酶能够在42°C的恒温下以指数方式自我扩增,倍增时间缩短至1小时。

Joyce认为:“这种复制品的最大应用是它是分子事件的信号放大器。”他指的是将催化结构域和配体结合结构域(适体,aptamer)结合起来,产生“适酶(apatazyme)”,这样扩增就成为配体依赖型。在配体存在时,适体序列是有序的,“适酶”的催化结构域也是,从而实现了指数级的扩增。但是当缺乏适当的配体时,整个分子就变得不稳定,连接酶活性也丧失。RNA的指数增长率取决于配体的浓度,这就能确定样品中配体的浓度。这个过程与定量PCR是相似的,但是适用性更广。多种目标都受用,包括与诊断和环境监测相关的蛋白和小分子。

随着适体开发成为一种常规的方法,该系统能用于检测从蛋白到代谢物的所有分子。同时,研究人员也在对适酶系统进行改进,Joyce认为一年内倍增时间将缩短至10分钟。根据这种分子的动力学特性,他认为1分钟也是完全可行的。(生物通 薄荷)

原文摘要:
Lam, B.J. & Joyce, G.F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nat. Biotechnol. 27, 288–292 (2009).

Lincoln, T.A. & Joyce, G.F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science 323, 1229–1232 (2009).

生物通编者注:
什么是适体?适体是与特异靶分子结合的寡核苷酸或肽段分子。它们通常从大的随机序列库中挑选而出,天然的适体也存在于核糖开关中。适体可用作基础研究,或作为高分子药物应用于临床。适体可分为核酸适体(DNA或RNA适体)及蛋白适体。

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