9月冷泉港实验手册聚焦ChIP[创新技巧]

在最新发布的冷泉港实验手册中，这一次奉上了ChIP和构建基因靶向载体两道免费大餐。

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

染色质免疫沉淀（ChIP）是一项炙手可热的技术，主要研究特定蛋白与基因组DNA区域的相互作用。ChIP可确定转录因子是否与候选目的基因相互作用，并监测组蛋白的翻译后修饰。

在早期的ChIP研究中，主要用紫外线来将蛋白与DNA不可逆交联。交联的染色质用超声处理，或用限制性内切酶来切割，产生较小的DNA片段，随后与特定抗体进行免疫沉淀。然后纯化沉淀的蛋白-DNA复合物，并用蛋白酶处理，再用放射性探针来进行点杂交或Southern blot。

现代的ChIP步骤经过了改进，用甲醛来取代紫外线，让蛋白-DNA、蛋白-蛋白可逆交联；PCR也逐渐应用到ChIP中，来检测沉淀的DNA片段。此次发布的protocol是哺乳动物细胞中标准的ChIP步骤。首先向正在生长的细胞中加入甲醛，进行交联，再制备染色质，用超声法剪切，并预先纯化以降低非特异性免疫沉淀。随后用特异抗体来进行免疫沉淀。从蛋白A或蛋白G琼脂糖树脂上洗脱蛋白-DNA复合物后，加热样品以取消交联。纯化出DNA片段，用PCR或定量PCR进行分析。

Construction of Gene-Targeting Vectors by Recombineering

此份操作手册可是来自大名鼎鼎的Wellcome Trust Sanger研究院，作者为Song-Choon Lee 和Pentao Liu。

培育基因敲除小鼠的关键是构建出基因靶向载体。重组技术大大简化了这个构建过程。此份protocol描述了如何利用pSim18质粒来构建条件性敲除的靶向载体。此质粒携带了pL启动子控制下的三个噬菌体Red基因（Gam、Bet、Exo），它们也被温度敏感型CI857抑制子所调节。因此，利用简单的质粒转化就能让细菌人工染色体（BAC）带上热诱导重组功能，可在大肠杆菌内操作克隆的小鼠基因组区域，构建条件性敲除载体。

实验的全过程如下图：