Roche/454用户畅谈测序样品制备[心得点评]

【字体: 时间:2009年09月29日 来源:生物通

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  像新一代测序这种复杂实验,光看Protocol怎么行?不仅要多看文献,还要自己不断摸索,才能慢慢积累出自己的经验。看看下面几位Roche/454用户关于样品制备问题的经验,说不定能让你少走些弯路。

像新一代测序这种复杂实验,光看Protocol怎么行?不仅要多看文献,还要自己不断摸索,才能慢慢积累出自己的经验。看看下面几位Roche/454用户关于样品制备问题的经验,说不定能让你少走些弯路。

Matthias Meyer和Richard Reinhardt都来自德国马普研究院,不过研究方向不同,Meyer是进化人类学,而Reinhardt是分子遗传学。Bruce Roe来自俄克拉荷马州立大学。Kenneth Nelson来自耶鲁大学。Agnes Viale则是斯隆-凯特琳纪念癌症中心的研究人员。

问题一:当你分离待测序的目的基因组区域时,如何确保准确性和重复性?

Matthias Meyer:除了全基因组鸟枪法测序,我们目前的目标是小基因组区域,它可以通过PCR或长距离PCR的预扩增而轻松富集。我们认为,长距离PCR的成功不仅与DNA质量有很大关系,还与PCR系统相关,评估几个不同厂家的试剂盒会有很大帮助。

Richard Reinhardt:我们不用454进行重测序,主要是用在新物种(de novo)测序和cDNA/microRNA文库上。

Bruce Roe:实际上我们很少聚焦特定的基因组区域,一旦需要,我们会利用降落(Touchdown)PCR以及第二轮的巢式引物和降落PCR来扩增目的基因组区域。

Agnes Viale:对于全基因组测序,我们利用几种不同方法(比如Qiagen的Dneasy和蛋白酶K/酚-氯仿提取试剂盒)提取的DNA来获得高质量的454数据。我们不认为纯化方法是一个关键因素,只要获得的DNA是高分子量的,且纯度高(260/280>1.7)。对于扩增子重测序,应该在扩增时使用带校正功能的聚合酶。我们一般利用AMPure Agencourt试剂盒来纯化PCR产物。我们还没有为长片段PCR产物的重测序而优化操作步骤。

问题二:如何优化起始DNA的量?

Matthias Meyer:如果你使用定量PCR来估计测序文库中的拷贝数,那么样品用量是很少的,1 ng或更少的起始材料就能产生足够的文库,基本上不需要优化起始DNA的量。Roche文库制备手册中建议的定量方法不够灵敏,安捷伦芯片检测则需要微克级的起始样品。因此,在运用454平台时,我建议进行定量PCR。它不仅能够将样品用量显著降低至纳克或皮克,以我们的经验还能得到更为一致的测序产量。我们用这种方法定量了100个左右的文库,大部分都给出了最佳的序列数。第一次使用该方法时,最好用一个现有的已滴定过的文库作为起始的参考值。

Kenneth Nelson:滴定是优化起始DNA量的最准确、最佳方法。我们还利用RiboGreen和PicoGreen(Invitrogen)分析来定量,以及安捷伦的生物分析仪来筛分。我们发现这些很重要,不能跳过。最近一个德国的小组发表了qPCR的方法,但我们还没试过。

Richard Reinhardt:我们一般是用安捷伦的仪器来检查质量,有时候也会用滴定。

Bruce Roe:我们一般用5到10 ug起始DNA来制备文库,在不同阶段,我们会在Caliper AMS-90上定量DNA。在emPCR步骤,我们使用的起始DNA比Roche推荐的量要低一些。

Agnes Viale:此步骤很关键。样品和磁珠的比例不合适会毁了一次运行。如果DNA是分离的条带,我们用PicoGreen的定量方法来计算样品的摩尔浓度。如果起始材料是弥散的,比如cDNA,我们还会根据安捷伦Bioanalyzer DNA 1000的结果来评估。这个方法是我们的经验,但它真的很好用。

问题三:你采用什么方法来确保样品制备步骤更快速?

Matthias Meyer:我们实验室在测序文库构建前会给多个样品贴上条形码。这一步增加了样品制备所需的时间,于是我们开发出多通道制备步骤,让移液机器人实现半自动化。一旦样品贴上条形码,Roche的标准测序文库制备步骤只需要几小时。不过,我们发现测序文库会很快降解。将文库分装,并立即冻存,能减少测序失败的风险,并节省很多时间和费用。

Kenneth Nelson:样品制备产生的DNA通常足够多次测序,所以一次小心的样品制备是非常高效的。我们还没有发现有任何捷径可走。

Richard Reinhardt:我们通常严格按照Roche提供的操作步骤。

Agnes Viale:在这一点上,我们仍是手工处理样品。为了降低试剂费用,我们先用不同的copy-to-bead比例对每个样品进行两轮或三轮emPCR。然后,根据磁珠回收的百分比,我们选择最佳的比例来处理剩余的样品。这个过程绕过了PTP的滴定,但是没有减少处理时间。总的来说,我们的样品制备是从星期一到星期四,在星期四晚上开始运行454。

你是不是也对454测序仪有点兴趣,那就赶快索取更多资料吧

(生物通 余亮)

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