Illumina用户分享测序样品制备的经验[心得点评]

像新一代测序这种复杂实验，光看Protocol怎么行？不仅要多看文献，还要自己不断摸索，才能慢慢积累出自己的经验。上一篇说的是Roche/454的样品制备，这一次就轮到Illumina的用户畅所欲言啦。

上一篇说的是Roche/454的样品制备，这一次就轮到Illumina的用户畅所欲言啦。Ghia Euskirchen来自耶鲁大学的Mike Snyder实验室。高原（音译）来自弗吉尼亚联邦大学。Stephen Kingsmore是美国国家基因组资源中心的专家。Anoja Perera来自美国Stowers医学研究所。

问题一：当你分离待测序的目的基因组区域时，如何确保准确性和重复性？

Ghia Euskirchen：我们Solexa（Illumina）仪器的大部分工作是ChIP测序。许多为ChIP-chip开发的标准也适用于ChIP-seq，抗体验证对所有ChIP实验都很关键。我们用IP-western以及质谱来验证抗体。对于重复性，我们会评估三个相同的样品，并关注对照位点。

高原：我们大致通过以下几点来检查准确性和重复性：1. 在目的区域定位读取；2. 利用Sanger测序来验证；3. 通过重复实验来查看相关性。

Stephen Kingsmore：国家基因组资源中心目前有两台Illumina的测序仪在运行中，第三台马上也要到了。我们主要有两方面应用：基因组DNA测序和mRNA测序。mRNA步骤是由Illumina的Gary Schroth小组开发的，我们一位同事又稍作修改，而我们的基因组DNA步骤是标准的。对于这些样品类型，我们利用LIMS系统来确保准确性和重复性，它对测序过程中的每个样品进行追踪。另外，我们还在测序仪和Infinium HapMap 550K基因分型芯片上同时运行一套样品，这有助于我们验证SNP检测的准确性。对于核酸变异检测，我们是利用自己开发的Alpheus软件系统（http://alpheus.ncgr.org/）。

Anoja Perera：到目前为止，我们只进行过全基因组范围的实验。以后，如果我们要分离基因组区域，我们也会进行验证实验。验证的类型将取决于分离了什么基因组以及分离的技术。如果我们是用长距离PCR，那么我们会跑胶验证。我们也可以用Sanger测序来验证扩增区域。

问题二：如何优化起始DNA的量？

高原：我们曾使用不同的DNA起始量来构建文库，并确定哪个浓度的结果更好。我们发现最重要的优化是起始的文库浓度。我们通常使用3 pM-4 pM的DNA来产生簇。测量文库浓度的办法有很多。我们是用混合法，先用Nanodrop来测DNA的量，然后和定量marker一起跑胶。这两种方法都是高度推荐，因为这个重要参数会决定你的最终测序结果。

Stephen Kingsmore：我们会在两个时候优化起始材料的量。一个是RNA文库产生的时候，另一个是生成簇的时候。加入过多或过少的文库都会使序列读取减少。而最佳数量的簇会在每个通道中产生500万个读取。我们利用安捷伦的Bioanalyzer来确定文库浓度，一般上样1 pM-3.5 pM。

Anoja Perera：对起始DNA来说，数量和质量都很关键。当然，高效的纯化技术是必不可少的。

问题三：你采用什么方法来确保样品制备步骤更快速？

Ghia Euskirchen：我们发现基因组和ChIP DNA文库制备相当简单。在文库制备时我们通常会将样品分开，以避免交叉污染。

高原：Solexa（Illumina）的样品制备已经足够简单了。我们几乎是按照它的操作步骤来做的。

Stephen Kingsmore：Illumina的样品制备过程很快速，大约需要一天，而且能同时制备几个文库。这个过程的瓶颈不在于样品制备，而是簇生成（我们有两台cluster station来应对）、序列生成（特别是产生46 bp读长时）、碱基检出和基因组比对。

Anoja Perera：提前熟悉一下操作步骤，确保所有的试剂和用品都能用。一定要有备用的。我们就曾试过两次错误扩增，如果没有备用的试剂，我们的实验就会延后。通读操作步骤，划出时间表。基因表达步骤需要三整天，如果准备不充分，你可能还要再多花8小时。在等待的时候浏览后续的步骤，了解哪些需要拿出来融化，以便节省时间。

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