利用差示扫描量热仪更好地指导抗体疗法的工艺开发[创新技巧]

【字体: 时间:2009年10月09日 来源:GE

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  确定pH和离子强度对蛋白稳定性的影响对于可靠的纯化步骤及配方策略的开发很关键。目前唯有毛细管差示扫描量热仪(DSC)能提供此类信息,且对药用蛋白的开发特别有用。本研究展示了DSC如何用于指导抗体和其他药用蛋白的工艺开发活动。

作者:Stephen Demarest博士,Biogen Idec

确定pH和离子强度对蛋白稳定性的影响对于可靠的纯化步骤及配方策略的开发很关键。目前唯有毛细管差示扫描量热仪(DSC)能提供此类信息,且对药用蛋白的开发特别有用。本文所描述的是DSC对IgG1和IgE这两种抗体形式作为药物的pH/离子强度稳定性研究。只有DSC能够对多结构域蛋白如抗体的单独结构域的稳定性进行研究。在此,DSC显示了IgE的恒定结构域片段(Fc)比IgG1 Fc对低pH/高盐条件更为敏感。这些结果表明IgG抗体常用的纯化和配方策略并不适用于IgE。本研究展示了DSC如何用于指导抗体和其他药用蛋白的工艺开发活动。

摘要

在目前的诊断或治疗应用中,γ同型免疫球蛋白,特别是人IgG1的生产和纯化是相当常规的。而以免疫球蛋白E(IgE)为基础的治疗只是在最近才显现出一些势头。1-3 在工业规模上生产、处理和配制IgE或IgE的恒定区域(Fcε)的标准方法尚未建立。尽管有关IgE生化功能及调控的很多知识都已知晓,但仍不清楚就热稳定性或pH敏感性而言,Fcε与Fcγ是否相似,以及处理IgG的标准方法是否适用于IgE。

IgE对于宿主抵御寄生虫和防御性炎症很重要。IgE介导的经其受体的信号通路还是炎症变态反应的焦点。4 IgE的恒定区域(Fcε)是同源二聚体,包含三个独特的Ig折叠结构域(Cε2、Cε3和Cε4)的重复对,并负责结合它的两个受体——FcεRI和CD23(也称为FcεRII)(图1)。

此篇应用指南聚焦在差示扫描量热仪(DSC)在指导IgG和IgE的生物治疗开发工艺的多个方面的应用。特别是,有证据表明DSC有助于了解IgG和IgE药物产品的处理、纯化及配制。将圆二向性(CD)对这些发现的贡献与利用DSC所能发现的进行了对比。DSC能够在多结构域蛋白的单个结构域水平上研究蛋白稳定性,在这方面圆二色性所获得的数据更加难懂。

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图1. IgG和IgE的示意图

材料与方法

纯化的Fcε、Fcγ和Fcγ-Cε2蛋白是由Biogen Idec产生的,描述见前文。5 圆二色性(Jasco)实验的细节请看前文。5 整套毛细管DSC实验(在不同pH值下的400多次扫描)在4个月时间内完成,而所花精力极少。准备Fcε和Fcγ的实验大约花了3个小时,包括蛋白浓度的测量、稀释和平板的准备;剩余实验都是由毛细管DSC本身自动完成的。完整的细节如参考文献5所描述。

结果

Fcγ和Fcε的pH依赖的去折叠

广泛的pH/盐稳定性是许多在工业环境中进行的亲和蛋白纯化过程的前提条件。对不常见pH或盐条件的耐受性差会产生聚集或无功能的蛋白。Fcε对不同pH/盐条件的耐受性是确定IgE/ Fcε包含蛋白的适当及可扩展纯化方法的重要信息。为了研究pH对Fcε二级结构的影响,我们获得了蛋白在pH 4.5到7.4的缓冲液条件下的圆二色谱。在pH 5.2到7.4之间,Fcε的谱是相同的,且在216到217 nm之间包含单个最小值,表明重要的β折叠和典型的Ig结构域。在pH 5,Fcε谱则以无规卷曲的方向迁移(最小值移向200 nm),而在pH 4.5,光谱暗示蛋白以无规卷曲为主。5 根据pH依赖的去折叠,我们研究了Fcε是否在pH 7.0与4.5之间稳定性减弱。

图2. A, B. Fcε (A)和Fcγ(B)在15 mM NaCl中的pH依赖DSC曲线。经过美国生物化学与分子生物学协会的许可,翻印自参考文献5。

Fcε在不同pH下的热变性是由远紫外圆二色性监测的。在pH 7.0,所有三个结构域(Cε2-4)的去折叠只有一个跃迁。在pH 6.0也观察到相似的跃迁,尽管表面TM降低了1°C。在pH 5.2的Fcε热去折叠产生了更广泛的跃迁,比中性pH下低了6°C。只有在pH 4.8,两种跃迁才清晰可见。5

根据最初的圆二色性结果,利用DSC开始对Fcγ和Fcε的pH依赖的稳定性进行详细研究。结果发现Fcγ和Fcε的去折叠跃迁是不可逆,且扫描速率依赖的(数据未显示),暗示不可逆聚集影响了两种蛋白的表面TM。6, 7 与利用圆二色性所能确定的不同,在低于8.0的所有pH下,Fcε显示出含有两种独立的去折叠跃迁(图2A)。其中一个跃迁会在低pH和高NaCl下变得不稳定,而另一个不会。

参与了pH敏感跃迁的结构域在pH 4.5时完全去折叠,正如利用圆二色性获得的结构数据所预测的——显示了DSC不仅对于了解折叠蛋白的稳定性很重要,对于它们的折叠状态也很重要。结果显示Fcγ(来自IgG1)通过两种单独的跃迁去折叠;低温度跃迁属于Cε2结构域,而高温度跃迁属于Cγ3结构域(图2B)。Cε2跃迁是通过去糖基化在热稳定性上的作用(未发表的结果)来鉴定的,而Cε3跃迁则是通过它的异常高热稳定性。8 两个Fcγ 结构域都表现出对pH和NaCl敏感。与Fcε不同,Fcγ结构域只有在pH降至3.0以下,才变成完全去折叠,暗示(1) 为什么在pH值低于3.5时抗体从蛋白A树脂上洗脱,(2) 为什么阳离子交换树脂适于IgG(图3)。

图3. Fcε 和Fcγ结构域热稳定性的pH依赖性正如它们的TM值所代表的。A. Fcγ结构域TM:15(▲)、150(●)和750(■)mM NaCl中的Cγ2;15(▲)、150(●)和750(■)mM NaCl中的Cγ3。B. Fcε结构域TM:15(▲)、150(●)和750(■)mM NaCl中的Cε3Cε4;15(▲)、150(●)和750(■)mM NaCl中的Cε2。经过美国生物化学与分子生物学协会的许可,翻印自参考文献5。

离子强度在稳定性上的作用

在高盐存在时,Fcγ 的Cγ2和Cγ3结构域以及Fcε的Cε3和Cε4 结构域都不稳定。这一点可从在5.0到7.0的中间pH范围内,它们在150和750 mM NaCl下的TM值相对于15 mM NaCl的微小改变中看出。这些小的稳定性差异不可能会对此pH范围内Fcγ 的体外半衰期产生重大影响,因为Cγ2和Cγ3结构域的TM仍然都在60°C以上。

Fcε的pH敏感结构域为受体结合结构域(Cε3和Cε4),这是通过对Fcγ-Cε2融合蛋白进行DSC实验而鉴定出的。Fcγ-Cε2和Fcε在pH 2.5下保持稳定折叠(图4)。根据上述实验,我们了解到Fcγ结构域在pH 3.0以下完全去折叠。通过缺省值,鉴定出Fcε的Cε2结构域为pH不敏感结构域。这些结果由pH 4.5下的Fcε有限蛋白水解来证实。5

图4. 利用Fcε(黑线)和Fcγ-Cε2(灰线)样品对同一种pH 2.5 磷酸缓冲液透析所获得的DSC曲线。Fcε和Fcγ-Cε2蛋白的示意图显示在DSC曲线上方。经过美国生物化学与分子生物学协会的许可,翻印自参考文献5。

在高盐下,Fcε的Cε2结构域的热稳定性略有增加。Cε2在中性pH和750 mM NaCl下特别稳定,其TM比15 mM NaCl所测得的TM高出7°C(图3B)。相比之下,在pH 5到6之间,NaCl显著影响了Cε3Cε4结构域的稳定性(图3B)。在pH 5.0的低盐中,Cε3Cε4开始去折叠。在高盐下,去折叠跃迁改变了0.5个pH单位(达pH 5.5),这阻碍了阳离子交换层析用作IgE或Fcε包含蛋白纯化步骤的可行性。

结论

在此项研究中,我们展示了Fcε 显现出不同寻常的pH敏感性,这导致其受体结合域在比Fcγ高2个pH单位(即pH 5.0)时去折叠。DSC所测定的Fcε pH/盐敏感性为选择纯化策略、操作步骤和IgE类蛋白的配方提供了宝贵的信息,并暗示标准的IgG步骤并不适用。Fcγ的pH稳定性数据还暗示了在标准的亲和纯化(如最常用的蛋白A树脂)时,IgG时间依赖性聚集的可能机制中包含了低pH洗脱和保留步骤。

Stephen Demarest博士是美国加利福尼亚州Biogen Idec蛋白化学部门的研究科学家。

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