专访：打破教科书定论 癌蛋白新机制

来自武汉大学生命科学学院，加州大学圣地亚哥分校的研究人员采用CLIP-seq技术，在基因组水平认识了可变剪接调控蛋白PTB（多聚嘧啶串结合蛋白）结合靶标pre-mRNA的特征，揭示出该蛋白通过结合在pre-mRNA的不同位置而对可变外显子的剪接实行正负双向调控的机制，从而打破了已写入教科书的、认为PTB是可变剪接抑制蛋白的传统观念。这一研究成果公布在《Molecular Cell》封面上。

　　

生物通报道：来自武汉大学生命科学学院，加州大学圣地亚哥分校的研究人员采用CLIP-seq技术，在基因组水平认识了可变剪接调控蛋白PTB（多聚嘧啶串结合蛋白）结合靶标pre-mRNA的特征，揭示出该蛋白通过结合在pre-mRNA的不同位置而对可变外显子的剪接实行正负双向调控的机制，从而打破了已写入教科书的、认为PTB是可变剪接抑制蛋白的传统观念。这一研究成果作为封面论文最近公布在《Molecular Cell》上。

文章的第一作者是武汉大学研究生薛愿超和周宇，通讯作者是武汉大学生命科学学院教授张翼博士和****讲座教授付向东博士（加州大学圣地亚哥分校教授和武汉大学的讲座教授）。张翼教授专业特长原本是核酶RNA的折叠和结构研究，通过与付向东教授合作，研究组于2004年下半年开始迈入人类可变剪接调控研究的大门，自此闯进了以非编码RNA为轴心的人类和哺乳动物的基因表达调控研究领域。张教授说，这真是一个奇迹，就像“北京欢迎你”那首歌唱的，有勇气就会有奇迹！

为了更进一步的了解这一重要的研究成果，生物通特采访了张翼教授，就读者感兴趣的一些问题请教了她。

生物通：传统观念认为PTB（多聚嘧啶串结合蛋白）是抑制可变剪接调控的模式蛋白，贵研究组的最新研究则发现，这一蛋白实际上可以通过结合在pre-mRNA的不同位置而对可变外显子的剪接实行正负双向调控，这对于基因转录后调控研究领域具有怎样的重要意义？

张博士：它革新了人们对剪接调控蛋白调控功能的认识，告诫本领域的专家们不能再以剪接抑制或者增强给一个调控蛋白进行分类。在我们的文章之前，已经有两个研究组报道（Darnell Lab，Nature 2008和Yeo lab, Nature structral molecular biology 2009）： 非传统的剪接调控蛋白Nova 和Fox2 的调控具有与结合位置相关的正负功能转换现象。我们组研究的PTB蛋白在剪接中的作用已经被研究了20年，是被盖棺定论的可变剪接抑制蛋白，而我们发现它可以通过结合在以前没有被发现的位置而促进剪接。因此，我们的发现应该是一个重要的里程碑，碑文是“研究可变剪接调控蛋白的功能必须考虑它的位置效应”。它同时指出，可变剪接调控的位置效应机制是一个新的研究方向。

生物通：贵研究组从哪些方面证明了PTB对可变外显子的调控新机制？

张博士：相比Darnell和Yeo的实验室发现可变剪接调控蛋白的位置效应而言，我们研究组对位置效应的机制进行了深入探索。

（1）首先是用RT-PCR 实验证明：PTB结合在可变外显子相邻内含子上广泛与促进可变剪接相关。共选择了五十多个我们用CLIP-seq方法鉴定出来具有显著PTB结合信号的可变外显子，检测其剪接事件如何响应PTB的敲除（用shRNA敲）。发现39个可变外显子的包含是随着PTB敲除而升高，与PTB的结合抑制可变剪接的理论一致；但是有17个随着PTB敲除而降低，与PTB结合促进可变剪接一致 。

（2）之后我们选择了其中一个例子CTTN基因（皮层肌动蛋白Cortactin基因，与癌症相关），针对其设计了迷你基因，即把可变外显子、两侧的内含子和组成型外显子一起克隆到质粒上。并对PTB结合位点进行删除，以检测该位点的功能。同时我们用shRNA把PTB和PTB相似蛋白nPTB进行敲低，用表达载体对PTB基因的通过可变剪接产生的两个蛋白PTB1和PTB4，以及nPTB进行分别高表达，以检测不同形式的PTB蛋白促进可变剪接的功能（Fig 3）。结果发现，（i) 该位点删除后，可变外显子的包含降低，证明该PTB结合位点对促进剪接必须.（ii）PTB/nPTB双敲后，可变外显子包含降低，而PTB4和nPTB的高表达能够恢复其剪接，PTB4比nPTB更加有效。（iii）如果PTB结合位点被删除了，三种形式的PTB都不能恢复剪接。这个实验确凿证明：PTB特异性结合在用CLIP-seq方法鉴定出来的靶位置上，促进可变外显子的包含。

（3）然后，我们把14个PTB增强和41个PTB抑制的可变剪接事件里的所有PTB结合标签（在可变外显子和它两侧内含子里的）进行了定位，看它们的分布特征。我们发现在抑制事件里，PTB倾向结合在可变外显子的两侧；而促进事件里，PTB结合富集在可变外显子相邻的组成型外显子附近。暗示PTB结合在组成型剪接位点附近可能抑制它们被剪接体识别的能力，从而增强了可变剪接位点获得剪接体青睐的竞争力。

（4）为了验证以上假设，我们把一段PTB结合的靶序列克隆到一个迷你可变剪接基因的不同位置。我们证明，PTB靶序列克隆在与可变外显子相邻的组成型剪接位点两侧，均能显著提高可变剪接效率。PTB敲除后，该增强消失；而PTB高表达会继续加强促进效率。该实验结果确凿证明PTB结合在组成型剪接位点附近会促进可变剪接。

生物通：实验研究过程中主要采用的技术是什么？贵研究组是如何想到利用这种方法的？

张博士：我们的核心技术是CLIP-seq，即紫外交联免疫共沉淀与高通量测序偶联技术。PTB是一个致癌蛋白，也是一个RNA结合蛋白，要想知道它的致癌机制，就需要知道它在癌细胞内的靶基因以及对靶基因的调控机制。我们使用CLIP-seq获取了PTB蛋白在宫颈癌细胞里结合的近五百万个结合标签序列，其中四百一十万是唯一标签。再把这些PTB结合标签放回人类基因组上，我们定位了PTB蛋白在该细胞基因组上的结合位置，共获得五万多PTB结合簇，分布在一万多个基因上。如果把人类基因组比喻成一个城市的道路，那么PTB蛋白就像该城市的一类建筑。而对PTB的标签获取就像卫星收集PTB建筑信号一样，通过解析信号，就可以将PTB蛋白的分布地型图展示给大家，并可以对PTB在任何一个基因街道上的准确位置进行导航搜寻。该“导航系统”无疑会推动科学家们快速和全面认识PTB蛋白的致癌机制以及它作为抗癌靶基因的潜力。

生物通：贵研究组下一步的研究计划是什么？

张博士：我们组研究的方向是RNA-蛋白质相互作用网络与人类表观遗传调控。我们不但尝试解析重要的人类RNA结合蛋白，譬如PTB，的RNA调控网络，也正在尝试解析人类microRNA与Argonaute蛋白形成的miR-Ago的RNA调控网络，并且已经取得很好的进展。我们研究组也非常关注其他的人类非编码RNA（ncRNA）和反义RNA（antisense RNA）等的研究，最近有一些非常令人振奋的发现。

如果问21世纪人们对生命规律认识的重要突破有哪些？我想有两点要包括在其中。第一，“真核的基因组是个RNA机器”（ The Eukaryotic Genome as an RNA Machine）。这是去年3月发表在Science 上的一篇观察文章的题目。人的基因组更是一个制造RNA的机器，整个基因组30亿对碱基93%以上都会被转录成RNA，但是编码蛋白质的只有1%。这个令人震惊的数据反差告诉人们，非编码RNA在人体正常活动以及疾病中的重要性远远超乎我们的想象，而我们目前对它的认识却是九牛一毛。而且最近的研究发现这些非编码RNA起重要的调控功能，譬如调控基因组动态性、细胞生物学、以及发育编程。第二，真核基因组的表达调控在细胞内是由一个立体的和动态的信号传输网组成。就像我国的交通网络包括铁路网，公交网，航空网，还有海运。解析这个网虽然有点让人望而生畏，但是随着高通量测序带来的技术更新已经给我们带来了重要机遇，譬如用ChIP-seq解析蛋白质与DNA之间的网络，以及CLIP-seq解析蛋白质与RNA之间的网络。

我们组对人和哺乳动物那神奇丰富的非编码RNA调控网络非常感兴趣，也期望我们所揭示出来的新规律给疾病治疗和抗病毒药物开发等带来新的有效策略。譬如以PTB蛋白作为抗癌靶标。

生物通：可变剪接调控是一种对于细胞分化、发育、癌症发生，以及干细胞功能维持等都十分重要的调控方式，您能谈一下这一领域的未来发展趋势吗？

张博士：第一、可变剪接调控机制的深度探索。新技术带来新数据，为本领域提出来新科学问题，也带来了新增长点。用CLIP-seq获得剪接调控蛋白的RNA结合图谱，这一技术革新激励整个领域去解析基因组上的剪接密码（splicing code），也为预测可变剪接调控的梦想再次扬起了风帆。为我们的文章写评论的西班牙科学家Juan Varcarcel在他的文章里说“The results of Xue et al.eloquently argue that high-throughput-enabling technologies provide panoramic views, illuminating mechanistic concepts that escaped the attention of researchers doing detailed work on more limited sets of genes.They also bring hope that RNA maps will one day allow us to navigate through genome sequences to predict their posttranscriptional outputs in different tissues or physio-logical situations."

第二、可变剪接生物学功能的全面开花。譬如去年在Nature发表的丙酮酸激酶基因的一个可变剪接异型体产生的蛋白质（M2）对癌细胞的生长非常重要。OCT4的可变剪接产物所产生的蛋白质对其干细胞功能维持也很重要（Stem Cells, 2008, 2009）。由质谱技术更新带来的蛋白组学技术的成熟，会为该领域的姹紫嫣红提供春风。

生物通：您曾在美国新泽西州医科大学等处进行研究学习，您认为这些海外学习经验对于科学研究最大的帮助是什么？

张博士：生命科学研究是探索未知的生命奥秘。需要勇气、胆量和执着的精神。现代的科学研究也需要许多人或松散或紧密地合作完成。所以需要勇敢大气的合作精神。还有科学研究的一个核心价值是培养人，而培养学生需要睿智、爱心和激情。这些我本人都非常缺乏，所以要不断超越自己。我在美国新泽西州医科大学（UMNDJ）研究学习六年，之前在Rutger大学做了近一年技术员，没有在顶级刊物上发表过论文，但是酝酿了我对RNA研究的真挚热爱。回想起来，那七年的学习经历对我进行科学研究最大的帮助，是我学会了对上帝的慈爱和大能的坚定信靠，这成为我个人面对未知的挑战不断前进和不断超越自己的推动力。

（生物通：王蕾）



（张翼博士和付向东博士联合研究组合影）